美国EPA 农药登记残留试验样品储藏稳定性资料要求概述

农药残留样品储存稳定性（Storage Stability，SS） 试验是要确定在从样品采收到样品分析期间， 总的农药有毒残留物在初级农产品或加工农产品中的稳定性或降解速率。一般情况下，农药残留试验样品从田间取样后要经过一段时间的储藏后才能够被检测。在储藏期间， 农药母体及其代谢物由于挥发或者发生一些水解，光解及酶促反应等可能会发生降解。因此， 为了确定样品中农药残留物的性质和残留水平在取样时与样品分析时的差异， 需要专门开展对照试验来评估样品储藏对总农药有毒残留物的影响。美国国家环保局（EPA） 从上世纪八十年代就开始了相关技术法规的制定工作。将美国环保局关于农药登记残留储藏稳定性试验的有关要求进行翻译整理， 希望对我国制定相关技术规范有所借鉴。

1 基本要求

1. 1 需要与残留试验同步开展

样品储藏稳定性试验需要与残留登记试验同时进行。若一种农药/残留物是挥发性或者不稳定， 样品储藏时间需<30d， 则农药登记管理机构可豁免其储藏稳定性试验。农药及其残留物是否属于挥发性或者不稳定则取决于该农药的基本物理性质和代谢试验研究结果。

样品储藏稳定性数据最好通常是作为残留试验数据的一部分， 而不是通过独立试验获得。将已知浓度的储藏稳定性样品与残留试验样品在同一条件下储藏， 可以保证试验物质的同一性。若样品在储藏过程中储藏条件发生变化的情况， 如冷库或冰箱遭遇断电等， 则储藏稳定性试验样品可以用来研究温度升高对其残留水平的影响。

若有可能， 管理机构更倾向于储藏稳定性试验与相应的残留试验同步进行。由于再登记时不太可能获得所有的田间试验数据， 储藏稳定性试验则需与用于登记或再登记的新登记残留试验同时进行。有些情况下， 样品储藏稳定性试验并非必须。若能证明农药残留在基质中是比较稳定的， 且样品储藏稳定性试验的储藏条件（特别是温度） 与其残留试验相同， 则在不同冰箱所进行的单独的储藏稳定性试验是可以接受的。对于那些残留物已知或怀疑不稳定或易挥发的农药， 同步研究是必须的。对这些农药而言， 建议在残留试验之前先进行储藏稳定性研究， 在处理样品冷冻前以确定合适的储藏条件和最长时间。

1. 2 代表作物的样品分析

储藏稳定性试验可以接受作物分组。若能证明在指定的作物中残留稳定， 在相同试验条件下， 则在同组作物中的残留也可被推断为是稳定的。在作物分组组合里的大组在储藏稳定性试验中通常是可接受的。例如根茎类蔬菜的叶可与叶菜类蔬菜（芸苔除外） 合并。EPA至少需要5种不同作物试验数据。若一种农药在所有类型的作物上都有使用， 则建议进行储藏稳定性试验的作物为一种油料种子（大豆， 或坚果）， 一种非油谷物， 一种叶菜类蔬菜， 一种根类作物， 一种水果或果菜类蔬菜， 如柑橘或番茄。饲料玉米是一种非油谷物， 而不是一种油料种子。在这些研究中，作物部位是作为食品还是饲料都要考虑。换而言之， 残留数据与对应的作物部位和其最大残留限量的建立需要考虑， 如小麦籽粒， 小麦青饲料、小麦干草。

代表性作物导则针对一种农药会用于所有的作物组。许多农药只应用于这些组中的一部分作物。因此， 上述的5种作物并非一直是最合适的。因为EPA不能为所有可能的农药使用组合提供导则， 申请者需要就使用哪些代表性作物进行样品储藏稳定性试验提前进行判断。例如，假定一种农药仅仅在葫芦科蔬菜和核果类水果上使用， 这种情况下， 则每组作物中都要选择一种作物来进行储藏稳定性试验。申请者可就特殊农药使用组合所需要选择的试验作物问题与EPA进行沟通交流。

若发现农药残留在预先选择的某一种代表作物中不稳定， 且这组作物的组限量还没有制定， 则需要在该组作物中选择其他作物进行额外的样品储藏稳定性试验。

EPA收到的用于加工农产品残留试验数据作物主要有3类： 油料种子、谷物、水果及果菜类蔬菜（主要为柑橘、苹果和番茄）。因为有些加工农产品（如油和果汁） 基质与其初级农产品区别很大， 加工过程及储藏过程需要稳定性数据的支持。如果某种农药残留已证实在上述3种作物中的1种加工过的农产品中稳定， 通常情况下不再需要额外的加工农产品储藏稳定性数据，当然其前提是储藏条件相似， 而且样品的储藏时间不长于代表性加工农产品的储藏时间。

对作物而言， 该加工农产品导则针对那些农药使用于农药残留可能会浓缩的加工农产品的所有农作物。对于并非使用于所有作物的农药， 则需要在加工农产品上进行样品储藏稳定性试验而不是上述的3种作物类型。例如， 一种农药只用于根类作物， 则样品储藏稳定性试验则需要在马铃薯或甜菜的加工部位进行。

至于动物性产品， 则通常需要支持家畜饲喂或经皮处理研究的样品储藏稳定性试验。代表性产品则需要将考虑包括肌肉（牛或家禽）、肝（牛或家禽）、牛奶和蛋。若残留在这些基质中稳定， 不再需要对组织（脂肪或肾） 进行分析验证。

2 残留试验中样品储藏稳定性试验具体要求

2. 1 一般要求

通常对残留试验中所测定的总有毒残留物的每个化合物均需要有样品储藏稳定性试验的数据。一般情况下， 这意味着在农药最大残留限量中的残留定义中包括了这些化合物。若为农药最大残留限量包括的许多化合物的个案时， EPA允许使用残留代表性化合物来进行储藏稳定性试验。在遇到这类问题时， 申请者应向EPA咨询。

2. 2 测试化合物和分析方法

样品可来源于田间施药处理后的作物或家畜， 或者来源于添加已知浓度的每种待测物空白样品。通常情况下，样品储藏稳定性试验的分析方法要与残留试验所使用的分析方法相一致， 否则， 则需要提供与残留试验分析方法等同的数据。

在储藏稳定性试验中的样品同样可来自于使用放射性标记农药的代谢试验样品。如果使用这些样品， 则残留分析应该在残留试验中所使用“冷” 分析方法或其他有效的总有毒残留物定量方法。也就是说， 储藏稳定性试验数据不应该只是总放射性的简单计数。

若田间处理样品中农药残留没有检出， 或残留试验低水平接近于分析方法的定量限， EPA建议在储藏稳定性试验中使用添加空白样品。在储藏稳定性试验中的最小添加水平建议使用分析方法10倍的定量限（LOQ）， 且最小为0.1mg/kg。例如， IR-4的研究项目09058/啶虫脒/草莓， 其分析方法的定量限设为LOQ=0.01mg/kg， 储藏稳定性（SS） 样品添加为10×.01mg/kg=0.1mg/kg。这将会使因为回收率高度变异所导致的残留稳定的不确定性的可能性降为最小。如果在残留试验中发现所检测到的残留量比上述建议的最小水平高出很多， 则储藏稳定性试验添加浓度最好使用相似的残留水平。

在进行储藏稳定性试验和残留试验时， 都要避免分析方法的回收率和变异系数超出范围。不管是否为使用过的方法， 当储藏稳定性样品从冰箱拿出进行分析时， 每个时间点都要进行新的添加回收试验。若储藏稳定性样品的回收率明显高于或低于同步添加样品100%的回收率，允许对残留试验中的残留量进行修正。

在总有毒残留物多于1种化合物时， 如有母体化合物和多种代谢产物， 分析方法能够分别检测残留物中的每种化合物， 储藏稳定性试验样品应添加混合物。若分析方法将所有的残留物转化为一种基团， 则不建议使用添加混合标样或使用田间处理或风化残留物。当使用一种共性基团的分析方法时， 应该确定相关化学性质和毒性类型的添加混合物或使用田间处理样品的可接受性。例如， 所测定的残留物中许多成份有相似的慢性毒性， 则按接下来使用的1种共性基团方法添加1种混合物是可接受的。另外， 由于母体化合物氧化为相关代谢产物后其毒性有显著差异的， 则使用1种共性基团作为乙酰胆碱抑制类农药则不被接受。也就是说， 在出现后面的这种情况时， 检测方法需要分开检测每种代谢物。

2. 3 样品形态要求

用于储藏稳定性试验的作物样品形态， 如有匀浆， 粗切， 全部作物， 提取物等， 需要与用于残留试验的样品的储藏形态保持一致。有时储藏稳定性试验样品需要反映上述几种样品的形态， 如田间试验样品是匀浆后保存几个月， 在最终分析前提取物再保存几周， 样品储藏稳定性则需要以同样样品形态进行试验和检测。美国IR4充分考虑其可操作性， 一般选择用匀浆样品添加标样做储藏稳定性， 做为最坏的储藏条件。

如果一个储藏稳定性试验不能反映最终分析前提取物的储藏条件， 则整个储藏稳定性试验需要重做。空白样品提取物的添加若与残留试验样品的相应提取物的保存时间和保存条件相一致， 且以分析提取物中的残留以确定残留的稳定性则是可接受的。为避免这些额外的试验， 申请者可以在进行样品储藏稳定性试验时包括提取物的稳定性试验， 除非申请者的标准实验室操作规程是在提取当天就对这些提取物进行分析。

有时残留试验样品以完整的形态储藏， 同时储藏稳定性样品则以匀浆的形态保存。为保证样品能均匀的添加， 必须用匀浆样品进行储藏稳定性试验。若能证明残留数据稳定， 由于在储藏稳定试验中所使用的匀浆样品比使用整个作物更能代表更易降解的情况， 因此EPA会接受这些研究数据。匀浆过程能释放与农药或代谢物发生反应的酶或酸， 或其他化合物。在匀浆时若残留不稳定， EPA会基于个案进行讨论，在匀浆或采取其他措施， 如需要重复进行样品不同储藏形态或分析到采样时间的田间试验。在此结果的基础上， 以决定是否需要对样品以整个作物形态保存的残留量损失进行校正。影响该决定的主要因素包括匀浆样品残留量的损失程度和农药的风险状态。

如果样品储藏稳定性试验需要持续很久，通常更倾向于对样品进行萃取， 去除大部分或者全部溶剂后在-20℃或更低温度下储藏提取物。这样就减少了与具有降解农药能力酶接触的机会， 进一步保护了作物组织中“结合态” 的农药残留物。这与FAO 的有关导则要求是相一致。

2. 4 样品容器要求

正如许多样品储藏稳定性试验参数一样， 样品容器应与残留试验中的样品容器一致。但是， EPA认识到申请者标准操作规程是将残留试验样品储藏于塑料袋（便于处理和储藏未匀浆的大个体样品） 和玻璃瓶中（储藏较小的， 通常是匀浆后的， 添加了总有毒残留物的样品）。这两种容器的密封性可能不一样， 这两种材料对农药的吸附能力也不尽相同。但是， 只要农药是不易挥发的， 通常不会由于使用了不同的容器而导致试验报告被拒绝。

2. 5 储藏条件要求

EPA认识到在样品被分析的冷冻处理之前， 残留试验样品几乎都需要从田间转运到实验室。在运转运过程中， 应该保持样品的冷冻状态， 如放置干冰， 或尽可能缩短转运时间。样品储藏稳定性试验应模拟残留试验样品在分析前的储藏条件（温度、湿度、光照）。储藏温度应该为-20℃或更低。对那些已知的不稳定农药， 申请者应该考虑使用更低的温度以避免或最大程度降低储藏阶段农药残留的损失。样品需要保存于黑暗处， 以避免光化学反应。EPA强调从样品采集时， 到样品保存于实验室阶段， 为保证农药残留试验样品的完整性所做的工作。残留试验报告应描述实验室收到样品前， 样品是如何处理和保存的。

在以前的残留试验中， 尽管样品是保存于冰箱中， 但精确的储藏温度或许未知。若在再登记时使用这些数据， 则EPA会建议在两个温度（-20℃和-5℃） 下， 再进行样品储藏稳定性试验， 来解决以前登记时样品储藏温度不确定的问题。储藏于较高温度的样品， 应该先行分析。 若残留在此较高温度时也稳定， 则储藏于低温条件下的样品可以不用分析。

取样频率。EPA对储藏稳定性试验过程中的采样间隔并没有严格的要求。需要一个科学的时间点， 来确认残留试验中在最长储藏时间内残留物是稳定的， 或者如果有必要对损失进行校正时， 说明在每个不同的时间点残留的损失量。为明确在样品进行储藏时的残留量， 一般都需要在零时间点进行取样。最小取样次数取决于残留的稳定性和残留试验过程中样品的储藏时间。若样品储藏稳定性为几个月， 且残留稳定， 则只需要最终点和一些中间时间点（除零时间点样品外） 的样品数据就可以了。但如果样品储藏几年或在几个月的储藏期间， 发现残留降解明显， 则需要更多的时间点的数据。

若残留的降解相对较高， 则取样间隔可选择0、14、28、56和112d； 若储藏稳定性试验时间长， 残留稳定， 则建议选择0、1、3、6、12个月作为取样间隔。无论如何， 样品储藏时间需要包括残留试验中最长储藏时间。

残留试验储藏时间范围通常很大， 相应的储藏稳定性的试验不可能包括每次和每个试验的取样时间。在必须对残留损失进行校正和两个试验的取样间隔不匹配时， EPA通常会要求开展补充试验。EPA对每个分析物每次取样时的最小样品数也没有具体的要求。尽管许多情况下1个储藏样品（除了同步添加回收样品外） 就已经足够， 但EPA鼓励申请者额外准备一些备用的储藏稳定性样品以防止发生意外情况， 如同步回收率数据不好， 或明显异常的结果， 其他样品的数据或许能够对这些不使用的数据提供校正。若EPA需要储藏稳定性更多处理样品的分析结果， 或处理样品储藏结束时间比期望的更长，则备份的储藏稳定性样品同样可用。

2. 6 储藏稳定性试验储藏时间的要求

样品储藏稳定性试验的储藏时间一般应该与残留试验样品的最长储藏时间相同或更长。但是， 有些情况下样品储藏稳定性试验的储藏时间会较相应的残留试验样品的储藏时间短。若储藏时间较短， 残留降解较慢时， 采用稳定期储藏稳定性试验数据的外推来延长储藏期也是可以被认可的。这种外推只适用于至少有6个月的储藏稳定性数据， 并且除零时间点外， 还至少要有3个取样时间点的样品储藏稳定性试验数据。

在一些特殊情况下， EPA会接受来自田间试验平行样分析结果作为上述外推依据。有时，来自田间的处理样品或其他残留试验样品被分成几个部分， 一部分会被迅速分析， 如在收获后的30d以内， 而另外一部分为被冷冻储藏。如果冷冻储藏一段时间后， 冷冻样品部分的分析结果表明与在收获后30d分析样品部分的残留量一样， 则EPA也会考虑使用这些数据来支持残留试验。

但是， 当发现农药残留在任何一种作物中不稳定时， 前面提到的外推和平行样一般就不再适用了。为了让EPA接受这种特殊作物田间试验支持的方案， 需要提供农药残留物在其他作物上稳定的数据。

在登记阶段， 会存在究竟是使用新的作物田间试验数据， 还是使用样品储藏稳定性试验数据来支持原有的田间试验的问题。选择哪个试验则取决于两者谁能在较短时间内完成。例如， 田间试验对某种特定作物而言或许可用，但样品被储藏了4年而且没有可用的储藏稳定性数据， 在这种情况下， 为加快登记进程， 则EPA会要求做一个新的田间试验， 因为与4年的储藏稳定性相比， 该试验能在较短的时间内完成。

2. 7 美国IR-4项目储藏稳定性实验实例

IR-4通常在残留试验中对其所有残留实验都要求储藏稳定性试验的数据。IR-4工作计划书对储藏稳定性实验中有详细规定[7]， 使用添加匀浆后空白样品添加水平为分析方法定量限的10倍（即10×LOQ） 或接近实际残留量。如在取样后的30d以内完成样品分析， 储藏稳定性可以豁免。由于IR-4通常做特色作物或小宗农作物的残留试验， 已经掌握了大量相关农药的储藏稳定性数据， SS储藏要求时间一般0d （分析第一个样品的当天） 及样品的最长储藏时间相同或更长（分析最后样品之后）。如IR-4掌握了充分储藏稳定性数据， 储藏（SS） 0d亦可豁免。储藏稳定性（SS） 的样品至少保存5年。

3 储藏稳定性结果的使用

如果储藏稳定性试验结果表明， 在残留试验期间储藏阶段农药残留有限降解， 在该研究样品采集时的残留量会使用校正因子进行校正。但是， 如果在储藏阶段农药残留降解很快， 则需要重做该项试验， 并且在样品采收后就迅速对样品进行分析。根据经验， 当降解率达到30%时， 会使用校正因子。当超过该值时， EPA将进行储藏阶段不稳定化合物残留水平包括绝对值和相对值（总有毒残留物的百分数） 在内的考虑。

在使用30%的法则前， 降解程度通常会由方法的添加回收率来校正。也就是说， 某分析物储藏后的残留量应该是去除掉同步添加回收试验回收率之后的结果。例如， 某储藏稳定性试验原始添加水平为1.0mg/kg （通过0d时分析， 且由同步添加回收率75%的回收率进行校正）。在储藏一段时间后， 样品分析结果为0.63mg/kg，有近37%的损失。若同步添加回收率为70%， 则储藏样品中的校正残留量为0.63mg/kg/0.70 =0.9mg/kg。因此， 校正后的储藏损失率为10%，或者储藏样品的校正回收率为90%。不管储藏稳定性试验阶段的损失程度如何，申请者都不应该报告校正后的农药残留试验数据。这些校正应该由EPA来进行。该校正适用于储藏损失和分析方法回收率。但是， 若申请者能够完整的提供包括没有校正的残留量， 校正因子和校正后的结果的报告， 则EPA能够接受校正因子和报告校正的结果。

代谢研究中储藏稳定性要求。EPA有权对在植物和动物代谢研究中样品采集， 准备和储藏样品过程中关于样品完整保存做出具体要求。由于对残留物检测前的样品添加比较困难和代谢研究需要时间长， 目前EPA的观点是在样品采收后的4～6个月进行样品分析， 则一般不需要储藏稳定性试验， 除非有证据表明， 在试验阶段分析部位的基质和提取物在合适的储藏条件会阻止农药残留物的降解。

如果在样品采集后的4～6月内不能完成代谢试验， 则需要提供在样品采集到最后分析阶段农药残留没有变化的证明。这些试验可在该研究的初期和完成时， 由对代表性基质进行分析来进行。这些分析应该证明在试验时标记的农药残留物基本没有变化。若发现有变化， 如HPLC典型峰或薄层色谱点的消失， 则需要从样品采集到分析期间选一段较短时间进行额外的分析和其他试验。

4 试验报告的有关要求

储藏稳定性试验的报告应该包括如下具体描述：

储藏的样品， 未加工或加工的； 试验化合物； 试验设计和储藏条件， 如冰箱温度、储藏时间、容器类型等； 残留分析方法和仪器； 储藏稳定性结果和数据报告； 统计分析； 为了保证这些操作的有效性所采取的质量控制措施或预防措施， 包括以上每步的具体日期。

根据EPA的要求， 申请者描述试验样品是如何准备的， 如粗分、匀浆， 所使用的具体容器等都是非常重要的。如与在残留试验中样品制备或容器上有差异， 需要明确指出， 提供有价值的研究数据和依据。若已知， 应提供相应残留试验的主记录识别号。

当多个重复样品在同一时间点分析时， 每个样品不能只报告平均值， 所有检测值都应该列在报告中， 包括用同步添加回收率校正的结果报告， 如作物、分析物、残留量、储藏时间、同步添加回收率、储藏样品、储藏样品及校正回收率。

试验报告的格式和内容也非常重要。要有标题页或封面页。标题页和其他与本研究相关的文件要求， 如数据提交要求和机密数据请求程序。报告除了目录， 还要有摘要或前言。这部分内容应该包括试验的目的、前言（包括储藏验证数据简表）、样品制备和添加回收、储藏和取样过程、分析过程、计算方法。

试验材料部分要包括分析物的描述。如果使用了添加回收， 需要描述分析物的化学名、通用名、实验室名、CAS名， 还有纯度的检测/检查（所有列于参考标准物质表中的母体和其他任何相关代谢物） 和标准溶液的制备。如果使用了被风化的残留样品， 要确定在零时间点（定义为储藏稳定性试验开始的时间） 样品中分析物的性质和量。申请者认为合适的、且与提供在储藏稳定性试验确认试验过程中使用分析物质的完整的、详细的描述和鉴定相关的其他相关信息。

还要有供试作物信息。在储藏稳定性试验中所使用到的初级农产品， 如作物、品种或变种及植物学名， 特定的作物部位或加工农产品的识别。储藏稳定性试验中初级农产品样品的生长阶段， 一般条件， 如未成熟或成熟， 绿或熟， 新鲜或干等， 农产品的大小等。储藏稳定性试验前的初级农产品的处理或准备或样品的加工， 如修剪、清洁或其他残留去除方法， 混合、浓缩、切或提取等信息描述。

样品识别号， 样品来源、田间试验号、空白或风化残留样品、编码或标签信息， 应该与在样品采收时所给定的代码和标签信息一致。申请者认为合适的、且与提供所使用初级农产品完整的、详细的描述和鉴定相关的其他相关信息。

方法的描述， 如试验设计， 试验作物数据、分析数量、试验添加水平、每个化合物试验水平的重复数、采样间隔、供试作物对不同基质的代表性等； 试验过程， 如添加过程， 如果用到化合物添加到分析物质中的具体方式； 储藏条件， 应该提供温度、温度、光照、容器类型及尺寸、作物形态（提提物或浸提等）、样品大小及重量、储藏时间等参数； 取样， 描述在零时间和后续正常取样的取样过程， 研究持续时间应与相应的田间采集的残留试验样品的储藏

时间相当； 应提供样品制备时间（浸提或提取等）、添加或检测风化残留（零时间） 的性质和量、定期取样间隔、储藏结束、残留分析； 要有残留分析方法， 应提供标题、名称、时间和来源（科学文献或公司报告等）， 如果与残留试验所使用的方法相同， 则交叉引用分析方法部分的数据。

若使用的方法与田间试验样品残留分析方法和加工农产品方法一样， 讨论与此方法的偏离（试剂、规程、设备、操作参数等）。

还要有具体原理和分析步骤， 如提取或净化、衍生化、检测， 包括所作的任何修改， 化合物检测， 使用技术的确认等， 提取效率。

还应提供仪器使用和操作参数， 如检测器的构造及模式、类型及种类、柱子的填料及尺寸、载气、流速、温度、电脑、检测限和灵敏度、计算过程等。

还要有对具有特别预防要求的试剂或程序步骤的说明， 如避免安全和健康伤害。

还要提交分析时间要求， 如执行一个样品或完整的整个分析过程， 包括分析步骤。

还要提交残留量计算和回收率的详细计算过程。申请者认为合适的、且与提供所使用分析方法和残留试验结果计算相关信息。

试验报告还要有结果与讨论。残留结果要包括原始数据、稀释因子、峰高及面积、所使用的方法校正因子、公式及标准曲线、理论及检测的浓度、回收水平（范围）、回收率与储藏时间（降解数据）、储藏研究时间的合理性等；统计分析要包括对原始数据的统计测验进行描述； 质量控制以确保储藏稳定性有效的控制措施或预防措施； 申请者认为合适的、且与提供与储藏稳定性有效相关信息的完整、详细描述。

试验报告还应包括结论。对有关分析化合物在供试基质中稳定性与储藏时间的相关性进行讨论。还要提供项目负责人的真实性证明，包括签字、打印名、职称、单位、地址、电话、日期。附表或图。应提交样品储藏稳定性试验的原始数据表和一份基于作物和储藏的样品残留数据摘要表； 并提供相关的曲线图及流程图等。

（摘编自《农药科学与管理》）