丝氨酸羟甲基转移酶活性测定及酶学性质研究

郑桂花　赵倩　汪璨　陶涛　余龙江

摘要：通过测定苯甲醛在279 nm处的吸光度来确定丝氨酸羟甲基转移酶的活性，利用单因素试验分析Escherichia coli SRZ018菌株最适产丝氨酸羟甲基转移酶的条件。结果表明，最适产酶条件为pH 8.0，反应温度50℃，CTAB为0.03 g/L，DL-β-苯基丝氨酸浓度为200 μmol/L，PLP浓度为50 μmol/L，该条件下丝氨酸羟甲基转移酶的活性最高达到0.881 U/mg。

关键词：丝氨酸羟甲基转移酶：单因素分析；DL-β-苯基丝氨酸：L-丝氨酸；Escherichia coli SRZ018

L-丝氨酸属于非必需氨基酸，可用于合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱等前体。作为中间体，可用于合成L-色氨酸、L-多巴等。在医药、食品等领域均有较为广泛的应用。目前，生产丝氨酸的方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、生物发酵法和酶法，酶法以其反应过程简单、催化专一性强、反应条件温和及转化效率高等优点，受到国内外的普遍重视。近年来随着固定化酶和固定化细胞技术在氨基酸工业上的应用，使酶法成为生产L-丝氨酸的研究热点。

丝氨酸羟甲基转移酶（Serine Hydroxymethyltransferase，SHMT）是L-丝氨酸合成中的关键酶，催化甘氨酸和L-丝氨酸的相互转化。在丝氨酸羟甲基转移酶作用下，以5-磷酸吡哆醛作为辅酶，甘氨酸与N5，N10-亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。研究发现以甘氨酸为底物酶法生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸的含量与菌体含有的SHMT活性直接相关，SHMT活性越高，菌体产生的L-丝氨酸就越多，因此，获得高活力的SHMT是提高L-丝氨酸产量的关键。本试验根据已有的报道建立了一种快速、简易的SHMT测定方法，通过单因素试验优化产酶条件，提高酶活力，以期达到间接提高菌株由甘氨酸转化为L-丝氨酸的能力。

1.材料与方法

1.1菌株来源

E.coli-SRZ018菌株由华中科技大学生命科学与技术学院保藏。

1.2培养基

种子培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10g/L。

发酵培养基：玉米浆51.96 g/L，磷酸氢二钾5.88 g/L，甘油13.60g/L，谷氨酸钠5g/L，MgSO40.8 g/L，蛋白胨5g/L，脯氨酸0.5 g/L，维生素B6 0.5g/L。

1.3其他试剂

DL-B-苯基丝氨酸购自Biosharp公司，磷酸吡哆醛（PLP）、氢氧化钠、氨苄青霉素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和十六烷基三甲基溴化铵（cTAB）均购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

1.4方法

1.4.1菌种活化与培养 菌株培养的种子培养基为LB培养基，种子培养基和发酵培养基的装液量均为30 mL，250 mL三角瓶，121℃灭菌20 min，冷却至室温，分别加入氨苄青霉素，终浓度达到100μg/mL，混合均匀。将保存的冻干管菌种接种至LB平板活化，活化好的菌株按照5%的浓度接种至种子培养基，37℃条件下200 r/min振荡培养4.5 h，转接至发酵培养基，37℃条件下180 r/min振荡培养14 h。

1.4.2酶活测定 逆向酶活是丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）活力的主要评价指标，逆向酶活的测定原理：SHMT可以催化DL-B-苯基丝氨酸分解产生苯甲醛，苯甲醛在279 nm处有最大吸收峰，因此可通过检测酶反应液在279 nm处的吸光度计算SHMT酶活。

1）苯甲醛标准曲线的绘制：精确配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmoL/L的苯甲醛标准溶液，于紫外分光光度计279 nm处测定其吸光度，根据吸光度Az79m（y）和浓度（x）的关系绘图，得到苯甲醛标准溶液的线性范围、回归方程以及相关系数。

2）SHMT逆向酶活的测定：取一定量发酵液于5 000 r/min离心10 min，去除上清液，加入适量的去离子水洗涤菌体1～2次，去除上清液，加入配制好的底物1 mL，振荡混合均匀，于30℃水浴反应1 h，反应结束将反应液8 000 r/min离心5 min，取上清液稀释至合适浓度后测定A279，以去离子水稀释底物相同倍数的溶液为对照，根据苯甲醛标准曲线计算SHMT逆向酶活。

1.4.3E.coli-SRZ018产SHMT条件的优化 以酶反应液的各组分为基础进行单因素水平研究，以磷酸缓冲液控制反应体系的pH，每个条件重复3次，研究DL-β-苯基丝氨酸、PLP、pH、CTAB、温度等因素对E.coli-SRZ018生产SHMT活性的影响。

1）CTAB对SHMT活性的影响。取相同量的菌体，依次加入CTAB的浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/L，测定SHMT活性。

2）DL-B-苯基丝氨酸对SHMT活性的影响。CTAB的添加量为0.03 g/L时，向底物中加入DL-β-苯基丝氨酸，浓度依次为50、100、150、200、250mmol/L，测定SHMT活性。

3）PLP对SHMT活性的影响。在苯基丝氨酸添加量为250μmol/L、CTAB添加浓度0.03 g/L时，分别考察PLP浓度为10、20、30、40、50、60、70、80μmol/L时SHMT的活性，

4）酶的最适反应pH。最适反应pH因底物种类，浓度及缓冲液成分的不同而不同，分别用pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲液配制底物反应溶液，30℃保温1 h，测定SHMT活性。

5）温度对SHMT活性的影响。将底物溶液分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃水浴中保温1 h，测定SHMT活性。

2.结果与分析

2.1SHMT活性检测方法的建立

对苯甲醛标准溶液进行紫外扫描，考虑到当吸收波长小于240 nm时，吸收干扰较大，选定的波长应大于240 nm，对苯甲醛标准品进行全波长扫描。根据全波长扫描的结果，苯甲醛在279 nm处有最大吸收，故选定检测SHMT活性的波长为279 nm。

在波长279 nm的条件下，测定不同浓度的苯甲醛标准品的吸光度，结果如图1所示。由图1可知，苯甲醛的回归方程为r=0.000 5+1.026x，相关系数R2=0.998。上述结果表明，在0.05～0，80mmol/L范围内，苯甲醛在279 nm处吸光度和浓度的线性关系良好。

2.2CTAB对SHMT活性的影响

CTAB浓度过低会对细胞的破壁效果有一定影响，细胞不能完全破壁，胞内酶SHMT不能完全释放，相反，CTAB的浓度过高，会影响酶的活性，导致酶的活性降低，因此，有必要考察不同浓度的CTAB对酶活性的影响，结果如图2所示。由图2可知，CTAB浓度在0.01-0.03g/L时，SHMT活性逐渐增加，CTAB浓度为0.03g/L时，SHMT活性达到最大值0.278 U/mg。因此，选择0.03 g/L为最适CTAB浓度。

2.3DL-β-苯基丝氨酸对SHMT活性的影响

由图3可知，DL-β-苯基丝氨酸浓度在50-200μmoL/L范围内，SHMT活性持续增加，当DL-β-苯基丝氨酸浓度为200 μzmol/L时，SHMT活性达到最大0.780 U/mg，DL-β-苯基丝氨酸浓度为250 μmol/L时，SHMT活性缓慢下降。因此，选择200 μmol/L为最适的DL-β-苯基丝氨酸浓度。

2.4PLP对SHMT活性的影响

根据图4结果可知，PLP浓度在20-40 μmol/L范围内，SHMT活性由0.232 U/mg逐渐增加，PLP为50 μmol/L时，SHMT活性最高为0.378 U/mg。因此，选择50μmol/L为最适PLP浓度。

2.5SHMT的最适反应pH

如图5所示，丝氨酸羟甲基转移酶在pH 7-9之间，酶活维持在0.900 U/mg以上，pH<6时酶活相对较低，pH为8时，SHMT活性最大，达到1.184 U/mg。

2.6温度对SHMT活性的影响

如图6所示，温度对SHMT活性有很大影响，反应时间为1 h时，SHMT可以耐受较高温度，随着温度的升高SHMT活性逐渐上升，40-60℃范围内，SHMT保持相对较高的活性，50℃时酶活达到最大，为1.246U/mg，故选择50℃为SHMT的最适反应温度。

3.小结

本试验建立的丝氨酸羟甲基转移酶的测定方法，是一种快速、简易的方法，可用于E.coli-SRZ018菌株及其他产丝氨酸羟甲基转移酶菌种活性的测定。逆向酶活的最佳反应条件为pH 8.0，50℃，CTAB的浓度0.03 g/L，DL-β-苯基丝氨酸200 μmol/L，PLP为50 μmol/L，测得最优条件下的丝氨酸羟甲基转移酶的活性为0.881 U/mg。