预知子三萜皂苷体外抗脂质过氧化和红细胞溶血作用的研究

贺海波　秦文　曾建红　张敏

摘要：为了研究预知子三萜皂苷（TSAF）抗脂质过氧化和红细胞溶血作用，以昆明小鼠作为试验对象，采用分光光度法测定TSAF对自发性及CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC诱导的小鼠肝脂质过氧化的影响，测定TSAF对H₂O₂诱导的小鼠红细胞溶血的影响。结果表明，TSAF可抑制肝自发性脂质过氧化，对CCl₄、H₂O₂、Fe₂₊-VC诱导的肝过氧化损伤具有保护作用，能有效地抑制过氧化产物MDA的生成，具有抑制H₂O₂诱导红细胞溶血的作用，抑制率与TSAF浓度呈良好的量效关系。TSAF具有较强的体外抗脂质过氧化和红细胞溶血的作用，并呈一定的量效关系。

关键词：预知子三萜皂苷；脂质过氧化；丙二醛；红细胞溶血；抗氧化活性

预知子为木通科植物木通、三叶木通或白木通的干燥近成熟果实，是中医临床防治肝癌行气活血治法中的常用药物。其果味甜可食，也可酿酒，种子可榨油。三萜皂苷类成分是预知子中的主要成分，具有抗癌、抗忧郁和改善脑卒中后神经功能等广泛的生物活性和功效，迄今为止未发现毒性报道，故其在新药研究方面具有广阔的前景。本试验对预知子三萜皂苷（Triterpenoid saponins of akebiae fructus，TSAF）类成分的体外抗脂质过氧化作用进行研究，为后续的研发奠定基础。

1.材料与方法

1.1试验动物

健康清洁级雄性昆明种小鼠，体重（20±2）g，购自桂林医学院实验动物中心（生产许可证：SCXK桂2013-0002）。

1.2材料与试剂

丙二醛（Malondialdehvde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。三氯醋酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、自由基诱导剂CCl₄、H₂O₂和铁离子一抗坏血酸（Fe²⁺-VC）等均为国产分析纯。

1.3仪器与设备

HP70A冷冻超速离心机（Hitachi日立公司）：FSH-2A可调高速匀浆机（金坛市华控实验仪器厂）；D-1006-D2超纯水机（上海必能信有限公司）；SGW-1全自动旋转蒸发仪（上海摩速科学器材有限公司）：DU800紫外可见分光光度计（美国Beckman公司）。

1.4方法

1.4.1对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 小鼠禁食过夜后于次日颈椎脱臼处死，立即解剖取出肝脏，4℃生理盐水冲洗血液，剔除脂肪和结缔组织，滤纸吸干称重后剪碎，在4℃生理盐水中进行研磨，制成10%肝组织匀浆。试验分为对照组和5个剂量的TSAF组，取6支离心管，先在各管中分别加入1.0mL肝组织匀浆，然后在5个剂量的rSAF组中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，对照组加入蒸馏水0.1 mL。每组平行3管，混匀，将各组离心管于37℃水浴恒温振荡反应1.0 h，取出后流水冷却，然后向各管分别加入1.0 mL的20%TCA和1.0 mL的0，67%TBA，混匀，置沸水浴中振荡反应15min，取出后流水冷却，于3 500 r/min离心10 min，去除蛋白质沉淀，取上清液，-20℃冰箱保存待测MDA含量，按试剂盒说明测定肝组织匀浆中MDA含量，并计算抑制率（%）。

抑制率（IR）=[（对照组MDA-提取物组MDA）/对照组MDA]×100%

1.4.2对CCl₄诱导小鼠肝脂质过氧化的影响 按“1.4.1”方法制备10%肝组织匀浆。试验分为对照组（肝组织匀浆、蒸馏水和CCl4）和5个剂量的TSAF组（肝组织匀浆、各剂量的TSAF和CCl₄），取6支离心管，先在各管中分别加入1.0 mL肝组织匀浆，然后在5个剂量的TSAF组中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL TSAF 0.1 mL，对照组加入蒸馏水0.1 mL。每组平行3管，混匀，将各组离心管于37℃水浴恒温振荡反应30 min，取出后流水冷却，然后向各管分别加入20 μL CCl₄，混匀，继续水浴恒温振荡反应30 min，取出后流水冷却，以下步骤与“1.4.1”相同。

1.4.3对H₂O₂诱导小鼠肝脂质过氧化的影响 按“1.4.1”方法制备10%肝组织匀浆。试验分为对照组（肝组织匀浆、蒸馏水和H₂O₂）和5个剂量的TSAF组（肝组织匀浆、各剂量的TSAF和H₂O₂）。取6支离心管，先在各管中分别加入1.0 mL肝组织匀浆，然后在5个剂量的TSAF组中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，对照组加入蒸馏水0.1 mL。每组平行3管，混匀，将各组离心管于37℃水浴恒温振荡反应30 min，取出后流水冷却，然后向各管分别加入1.0 mL的0.1 mol/L H₂O₂，混匀，水浴恒温振荡反应30 min，取出后流水冷却，以下步骤与“1.4.1”相同。

1.4.4对Fe²⁺-VC诱导小鼠肝脂质过氧化的影响按“1.4.1”方法制备10%肝组织匀浆。试验分为对照组（肝组织匀浆、蒸馏水、FeSO₄·7H₂O和VC）和5个剂量的TSAF组（肝组织匀浆、各剂量的TSAF、FeSO₄·7H₂O和VC）。取6支离心管，先在各管中分别加入1.0mL肝组织匀浆，然后在5个剂量的TSAF组中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1mL，对照组加入蒸馏水0.1 mL。再向各管中分别加入50 μL FeSO₄·7H₂O（终浓度为2.0 mmol/L）和50 μLVC（终浓度为1.0 mmol/L）。每组平行3管，混匀，以下步骤与“1.4.1”相同。

1.4.5对红细胞溶血的影响 小鼠眼眶采血1～2 mL，加入肝素钠抗凝剂后，于3 500r/min离心10min，分取红细胞沉淀后，用生理盐水洗涤3次，制成终浓度为0.5%小鼠红细胞悬浮液。试验分为对照组（红细胞悬浮液、蒸馏水）和5个剂量的TSAF组（红细胞悬浮液、各剂量的TSAF）。取6支离心管，先在各管中分别加入1.0 mL红细胞悬浮液，然后在5个剂量的TSAF组中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL TSAF 0.1 mL，对照组加入蒸馏水0.1 mL。接着在5个剂量的TSAF组中再加入0.05 mL 100mmol L H₂O₂，对照组加蒸馏水补足体积。每组平行5管，混匀，将各组离心管于37℃水浴1 h，用生理盐水稀释5倍，于3 000 r/min离心10min，分取上清液，采用紫外可见分光光度计于540 nm处测定吸光度值（A_540nm），计算溶血抑制率。

溶血抑制率=[（对照组A-提取物组A）/对照组A]×100%

1.4.6统计学方法 所有计量资料采用均数±标准差表示（x±s）。采用SPSS 13.0统计分析软件进行数据分析，计数资料比较用X²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果与分析

2.1对肝自发性和CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC诱导脂质过氧化的抑制作用

由表1可知，与对照组比较，自发性脂质过氧化、CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC诱导脂质过氧化试验中5个剂量TSAF组小鼠肝组织中MDA含量与对照组相比均显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01）。随着TSAF浓度的增加，MDA含量逐渐下降，且其抑制率随浓度的增加而呈上升的趋势。表明TSAF不仅对小鼠肝自发性脂质过氧化产物MDA的生成有抑制作用，而且对CCl₄、H₂O₂、Fe²⁺-VC诱导的脂质过氧化产物MDA的生成也表现有相同的抑制作用，其抑制作用与TSAF浓度存在一定的量效关系。

2.2对红细胞溶血的影响

由表2可知，与对照组相比，5个剂量TSAF组吸光度值均显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01）。随着TSAF浓度的增大，吸光度逐渐减小，抑制率逐渐加强，最高溶血抑制率达到91.27%，表明TSAF具有很好的抑制红细胞溶血的作用，说明TSAF对红细胞溶血的抑制作用与其浓度存在一定的量效关系，

3.讨论

机体在正常状态下，不仅有氧自由基产生系统，而且还有清除自由基的抗氧化系统，一方面通过正常的组织代谢产生自由基，另一方面依靠自身的自由基清除系统使体内自由基的产生和清除处于一个动态平衡的状态。而当机体在病理情况下，自由基的产生和清除失衡，自由基产生的数量会急剧增加，过多高活性的自由基在体内存在时，可对机体产生一系列的损害作用。脂质过氧化是体内氧自由基能攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸而引起的一系列有害氧化反应，它大部分由肝细胞产生，其分解也主要在肝脏。当自由基在体内的产生增加时，可以产生一系列脂质过氧化物，MDA是由自由基引发的脂质过氧化物的最终产物。MDA含量越高，提示细胞膜脂质过氧化程度就越高，细胞膜损伤也就越严重。MDA可导致人体细胞氧化损害、老化、癌变等，它与肿瘤、心血管疾病、衰老、炎症、自身免疫等疾病的发生密切相关。MDA含量可间接反映机体的脂质过氧化水平，它是目前评价氧自由基损伤的最常用方法。

CCl₄是一种典型致肝脏损伤的化学性毒物，CCl₄经肝氧化酶系统作用后，生成过氧化三氯甲基自由基（·OOCCl₃）和三氯甲基游离基（·CCl₃）等自由基，它们通过攻击肝细胞膜上的磷脂分子而引起脂质过氧化反应，使MDA含量增加。Fe²⁺是一种常见的自由基链式反应促进剂，Fe²⁺也可促进脂质过氧化反应的发生，使MDA的生成量增加。H₂O₂是活性氧家族中的一员，在H₂O₂氧化剂的作用下，可以产生更强活性的·OH，并诱发多聚不饱和脂肪酸氧化，MDA增加，生物膜的功能和结构受到破坏。本研究结果表明，TSAF可明显抑制小鼠肝自发性脂质过氧化产物MDA的生成，并且TSAF以剂量依赖方式抑制体系MDA的产生，TSAF的这种抑制作用不但表现在肝自发性脂质过氧化，而且还表现在由CCl₄、H₂O₂和Fe²⁺-VC等氧化剂诱导的脂质过氧化，表明TSAF具有良好的抗氧化作用。H₂O₂能单独与红细胞作用使红细胞溶血及膜脂质发生过氧化。红细胞在体外与H₂O₂反应后也可产生脂质过氧化的主要产物MDA，损伤红细胞膜，使之容易产生溶血。此次试验结果显示，TSAF对红细胞溶血有明显的抑制作用，随浓度增加抑制效果逐渐增强，提示TSAF对H₂O₂诱导的红细胞溶血有明显的抵抗作用。总之，TSAF在体外具有较强的抗脂质过氧化和红细胞溶血的作用，这为进一步开发预知子药用和食用价值提供了理论依据。