龙脉宁方中葛根素在心肌缺血大鼠体内药动学惨┬а相关性研究

董林娟 张文娟 刘诗雨 王昌利 宋逍

[摘要]研究龙脉宁方中葛根素在正常及心肌缺血模型大鼠体内的药动学过程及其与龙脉宁方抗心肌缺血作用的相关性。该文建立了大鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素（ISO）复制心肌缺血模型，灌胃给予FFLMN提取物溶液后不同时间点眼眶采血，HPLCUV检测大鼠血浆中葛根素浓度，比较灌胃相同剂量FFLMN龙脉宁正常组和模型组大鼠体内药动学差异。同时，采用酶标仪测定各时间点血浆中IL6及SOD活性，绘制药效曲线。结果表明，正常组心肌缺血模型组大鼠血浆中葛根素浓度药动学均符合二室模型，比较2组主要药动学参数，葛根素在正常AUC0∞=（11451±3228） mg·h·L-1，AUC0t=（14047±3765） mg·h·L-1，Cmax=（5623±140） mg·L-1。治疗组AUC0∞=（68849±50396 9） mg·h·L-1，AUC0t=（58312±45802） mg·h·L-1，Cmax=（18456±7517） mg·L-1。血浆中SOD水平显著升高，IL6浓度显著下降。表明与正常组相比，复方龙脉宁中葛根素在心肌缺血大鼠血浆中血药浓度高，消除速度慢，生物利用度高，血浆中葛根素浓度与龙脉宁方抗心肌缺血作用有关，能够升高SOD水平，抑制IL6的释放。

[关键词]复方龙脉宁； 葛根素； 心肌缺血； PKPD； SOD； IL6

[Abstract]To study the pharmacokinetics of puerarin in compound Longmaining（FFLMN） in normal rats and myocardial ischemia rats， and investigate its correlation with antimyocardial ischemia effect of FFLMN Models of myocardial ischemia rats were produced by subcutaneous injection of isoproterenol（ISO）， then FFLMN extract solution was administered by gavage Orbital sinus blood sampling was collected at different time points after gavage HPLCUV method was applied to determine the concentration of puerarin in plasma， and compare the difference in pharmacokinetics between normal rats and model rats after application of same dose of FFLMN Meanwhile， microplate reader was used to determine IL6 and SOD activities in plasma of different time points， and draw doseeffect curve The results indicated that the pharmacokinetics of puerarin conformed to the twocompartment model in both normal group and myocardial ischemia model group In the comparison of main pharmacokinetic parameters between two groups： AUC0∞=（11451±3228） mg·h·L-1，AUC0t=（14047±3765） mg·h·L-1， Cmax=（5623±140） mg·L-1 in normal group； AUC0∞=（68849±50396 9） mg·h·L-1， AUC0t= （58312±45802） mg·h·L-1，Cmax=（18456±7517） mg·L-1 in treatment group The SOD level was significantly increased and IL6 concentration was significantly decreased in plasma， indicating that as compared with the normal group， puerarin in FFLMN had a higher plasma concentration， slower elimination rate and higher bioavailability Therefore， puerarin concentration in plasma has correlation with the antimyocardial ischemia effect of FFLMN， which could increase SOD level and inhibit the release of IL6

[Key word]FFLMN； pueraria； myocardial ischemia； PKPD； SOD； IL6

doi：10.4268/cjcmm20160828

冠心病是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起的血管腔狭窄或阻塞，造成了心肌缺血、缺氧、坏死而导致的心脏病。近几年，心脑血管疾病成为了一种严重危害人类健康的疾病。世界卫生组织在2008年发布，全球死亡人数中有29%是死于心脑血管疾病[1]。那么战胜心脑血管方面疾病成为了人类医疗的一个重大问题。

复方龙脉宁（FFLMN）是由陕西中医药大学附属医院脑病科教授陶根鱼根据自身多年临床经验所得的经验方。全方由葛根、川芎、穿山龙、蜂胶4味药组成，有通络活血通络、化瘀解毒的功效，在临床上主要用于治疗中风所导致的半身不遂、口眼歪斜、肢体麻木以及胸痹所致的心悸、胸闷、气短等症状[2]。方中葛根是全方的君药，现代药理研究表明葛根中主要有效成分葛根素具有扩张冠状动脉，改善心肌代谢，改善微循环，抗心律失常，降血压等作用。所以，本文以葛根素为指标性成分进行检测，来说明龙脉宁在大鼠体内的药动学过程。

PKPD是指将药物动力学和药效动力学相结合，反映了机体与药物之间的互相作用。其中，机体对于药物的作用可以用药动学模型表述，有吸收、分布、代谢、排泄4个环节，在模型中以体内血药浓度随时间的变化进行表述。药物对于机体的作用可以在药效学模型中反映，描述效应随浓度而变化的药效动力学过程[34]。本实验以心肌缺血大鼠为实验动物模型，以FFLMN中主要药效成分葛根素为药代指标，以超氧化物歧化酶（SOD）及白介素6（IL6）为药效学指标[57]，建立PKPD模型，评价FFLMN在心肌缺血大鼠中药动学及药效学的相关性，为临床抗心脑血管疾病提供合理依据[8]。

1材料

U3000型反相高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；iMark酶标仪，BioRad Laboratories，Inc；YZN50超高速真空低温（浓缩）抽出机，北京东华原医疗设备有限责任公司总经销；N1200B，EYELA旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；DZF6050真空干燥箱，上海恒科有限公司；HH2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；KH400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司； 1/1万JMB5002电子天平，余姚市纪铭称重校验设备有限公司；XYJ2台式高速离心机（江苏）恒丰仪器厂；冷冻离心浓缩仪，DUC23050J00，青岛路博伟业环保科技有限公司；MS2 IKA旋涡混合振荡器，北京联合科技有限公司。

葛根素对照品，纯度≥98%，购自中国食品药品检定研究院，批号110752201313；穿山龙、川芎购自西安盛兴中药饮片公司；葛根药材购自宝鸡向源中药饮片有限责任公司，经陕西中医药大学药学院生药教研室王继涛教授鉴定为豆科植物野葛的干燥根茎；蜂胶购自陕西省咸阳市自然之子蜂产品公司，经陕西中医药大学生药教研室雷国莲教授鉴定为正品蜂胶。超氧化物歧化酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所；IL6，ELISA测定试剂盒购自R&D公司；盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）购于Sigma公司；粮食乙醇（质量分数95%）和氯化钠注射液购自辰欣药业股份有限公司，批号1408132701；羧甲基纤维素钠购自天津市天力化学试剂有限公司，批号20131029；甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

清洁级雄性SD大鼠，体重（280±20） g，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，合格证号SCXK（军）2012006。动物饲养于陕西中医药大学药学院药理实验室，提供标准动物饲料，自由进食饮水，实验前夜禁食，自由饮水。

采用DAS 211药代动力学软件对血药浓度进行数据处理，采用二房室模型计算主要动力学参数，实验数据以±s表示。

2方法

21药物的制备

称取葛根1 200 g，川芎800 g，穿山龙800 g置于提取罐中，加入8倍量70%粮食酒精，提取3次，每次2 h，合并3次提取液，回收乙醇，离心，提取液浓缩至3 000 mL，称取预处理过的AB8大空树脂3 000 g装柱，水洗至无醇味，上样，80%乙醇05 BV·h-1洗脱，4 BV完全洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，水浴浓缩，真空干燥。按复方处方葛根川芎穿山龙蜂胶3∶2∶2∶1加入已除过蜡的蜂胶，混匀，制成FFLMN提取物。

22心肌缺血模型制备

取SD大鼠10只，用10%水合氯醛溶液以30 mL·kg-1大鼠腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，将针状电极刺入大鼠四肢皮下，将心电图灵敏度调节至1 mV=20 mm，走纸速度50 mm·s-1，稳定15 min后Ⅱ导联描记大鼠心电图。按50 mg·kg-1皮下（sc）多点注射ISO生理盐水，每天注射1次，连续给药3 d，复制心肌缺血模型。第2天造模后，测定大鼠心电图，与造模前心电图相比，以T波抬高、降低或倒置作为评价心肌缺血模型制备成功的指标[9]，筛选出5只造模成功的大鼠。

23给药及血样的采集

将大鼠分为正常组和模型组，各5只，正常组大鼠ig前于眼眶静脉丛采集空白血，模型组在末次皮下注射ISO后30 min眼眶静脉丛采集空白血，随后ig给药FFLMN提取物溶液10 mL·kg-1。所有大鼠给药后017，033，05，075，1，2，3，4，6，8，10，12，24 h眼眶静脉丛采血至肝素化EP管中，5 000 r·min-1冷冻离心10 min，吸取上清液，置-80 ℃冰箱，备用。

24大鼠血浆样品中葛根素的测定

241色谱条件Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇水（21∶79），流速10 mL· min-1；检测波长250 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

242葛根素对照品的配制精密称取葛根素对照品264 mg于50 mL量瓶中，制成每1 mL含528 μg的对照品溶液作为储备液。用甲醇梯度稀释，配制成质量浓度分别为066，132，264，528，1056，112，5280 mg·L-1的葛根素对照溶液，置于4 ℃冰箱保存[9]。

243血浆样品的制备取大鼠血浆100 μL，加400 μL甲醇，置涡旋振荡3 min，1 000 r·min-1离心10 min，取全部上清液后在沉淀中加入200 μL甲醇再次涡旋离心，合并2次上清液。置冷冻离心浓缩仪中40 ℃离心干燥，样品干燥后用流动相定容至100 μL，超声10 min，涡旋混合1 min，再以1 000 r·min-1离心10 min，上清液过022 μm微孔滤膜。取10 μL，进样。

244受试品的配制FFLMN提取物2566 g（相当于葛根素），加水定容至100 L，混合均匀，供大鼠灌胃用。

3结果

31方法学考察

311色谱行为及专属性实验空白血浆中加入葛根素对照品溶液配制成含葛根素2112 mg·L-1血浆样品溶液，ig FFLMN 30 min后大鼠血浆样品的色谱行为，色谱图见图1，结果表明葛根素与血浆中其他内源性杂质的分离效果良好。

312标准曲线的制备取葛根素系列对照溶液，以243项下方法处理，以葛根素血药浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做标准曲线，线性方程为y=0611 8x+0037 5，r=0999 7，表明葛根素在066～528 mg·L-1线性关系比较好。

313精密度试验取空白血浆100 μL，分别配制成含葛根素质量浓度为2112，528，132 mg·L-1的血浆样品各5份，按243项下方法处理，100 μL流动相复溶后保存于冰箱内，于日内同一样品每隔2 h测定1次，共测定3次，计算日内、日间精密度，结果见表1，日内和日间RSD均<10%，符合药动学检测要求。

314稳定性试验取空白血浆100 μL， 加入高，中，低3种不同质量浓度葛根素对照品溶液，各5份，分别考察室温放置4 h，4 ℃冰箱放置4 h，置-20 ℃反复冻融3次，-20 ℃放置7 d后，样品按243项下方法处理，检测，计算样品稳定性。发现样品中葛根素含量无明显降解，室温、冻融等状态下均保持稳定，其中高、中、低3种质量浓度的RSD分别为15%，092%，20%。

315回收率试验流动相配制高、中、低（相当于葛根素质量浓度2112，528，132 mg·L-1）标品溶液各5份，测定其峰面积作为A1。 取空白血浆100 μL，配制葛根素高、中、低3种浓度各5份，按243项下方法处理，加100 μL流动相复溶，测得峰面积为A2。另取空白血浆100 μL，以23项下方法处理后，加入高、中、低3种不同浓度的葛根素对照溶液，测得的峰面积为A3。以A2/A1为方法回收率，A2/A3作为提取回收率，结果见表2，提取回收率和方法回收率均在要求的范围内，所以该方法合理可行[9]。

32大鼠血浆样品中SOD和IL6的测定

按照试剂盒使用说明书操作，采用黄嘌呤氧化法测定大鼠血浆样品中SOD活性，双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆中IL6浓度。

33药代动力学试验

正常组与心肌缺血组大鼠ig FFLMN提取物后，葛根素血药浓度随时间呈动态变化，其药时曲线见图2，主要药动学参数见表3。药动学数据显示FFLMN中葛根素在正常及心肌缺血大鼠体内的药动学过程存在一定的差异。结合2组之间的t1/2β，AUC0∞，Cmax等药动学数据可知，与正常组相比，葛根素在心肌缺血大鼠体内血药浓度高，吸收率好，且在体内消除速率慢，滞留时间比较长。说明方中葛根素在心肌缺血疾病大鼠体内的生物利用度与正常大鼠相比生物利用度大大增加，有利于药效发挥，为临床合理用药提供实验依据[9]。

34药效学结果

正常组大鼠空白血浆中SOD为（15478±429） U·mL-1，IL6为（3029±587） ng·L-1，经实验研究发现正常组SOD和IL6在灌胃复方后随时间变化不明显，故未做统计，与正常组相比，模型组大鼠空白血浆中SOD为（12421±1197） U·mL-1，显著降低，IL6为（7934±751） ng·L-1，升高明显。表明心肌缺血模型造成了大鼠体内缺氧和炎症的发生。模型组大鼠给予FFLMN提取物后血浆中SOD水平有所回升，IL6浓度明显降低，模型组ig给药后大鼠血浆中SOD与IL6随时间变化时效变化，见图3，FFLMN提取物可以有效改善大鼠心肌缺血所带来的缺氧和炎症等因素[10]。

35药动学与药效学相关性拟合

依据上述药动学和药效学实验结果，对心肌缺血组FFLMN方中指标性成分葛根素的药动学和药效学数据进行拟合，结合药动学拟合出浓度时间效应曲线，见图4。从图中可以看出大鼠ig FFLMN提取物后，血浆中葛根素的浓度与SOD活性在0～072 h内成正比趋势增长，072～1 h葛根素浓度开始逐渐下降，SOD增长到最高水平，之后SOD开始下降，4 h后SOD的活性慢慢趋向正常值。血浆中IL6的浓度在0～05 h成一定的上升趋势，05 h后随着血浆中葛根素浓度的继续增大，IL6的浓度开始降低，3 h后血浆中IL6浓度逐渐趋于正常[11]。

4讨论

本实验同时研究FFLMN中葛根素在心肌缺血及正常大鼠体内的药动学特征，结果显示在心肌缺血模型体内葛根素的吸收效果明显优于正常组，同时代谢速度慢于正常组，这种差异一方面应该是与心肌缺血“证”相联系的，表明用FFLMN治疗心肌缺血疾病的临床合理性，反映中医理论上的方证对应思想[12]。另一方面可能源于缺血机体会导致代谢物的消除速度减慢。实验中大鼠灌胃的剂量在临床用药大剂量组的基础上增加了10倍。

近代药理研究表明，心、脑血管类药物的抗心肌缺血作用涉及抗氧化、抗炎证、扩张冠状动脉硬化、促进血管新生及诱导血管内皮松弛因子NO的释放等多种机制的变化[13]。本课题前期的药理研究发现，FFLMN对寒凝血瘀及药物等因素所致的心肌缺血动物均具有一定的治疗和保护作用[1415]。本实验是在此基础上，以心肌缺血大鼠血浆中SOD，IL6水平与葛根素的血药浓度为依据建立PKPD模型，进一步研究了FFLMN中葛根素在心肌缺血大鼠体内药动学药效学相关性，建立了龙脉宁方的药效学与药动学同步分析统一模型。在研究中发现病理组大鼠在ig龙脉宁提取物后血浆中葛根素与效应有一定程度的滞后现象，在前期文献研究中发现，大多数药物都具有此类现象[16]，产生这种现象的原因大致有3种：第1种是由效应室引起的滞后，药物由中央室传递到效应室需要一定的平衡时间，造成效应滞后的现象；第2种是由药物在中央室分布从而造成的滞后；第3种就是药物起效需要一定时间所造成的滞后，许多药物到达效应部位较快，然而起效较慢[17]。具体是哪种现象所引起的效应滞后现象还需进一步探讨。同时，FFLMN方中有4味药物，但由于复方的复杂性和效应的多样性，另外3味中药的指标成分在该方治疗心肌缺血疾病中是否会产生协同作用及其与药效之间的关系有待于进一步研究。

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[责任编辑曹阳阳]