灰毡毛忍冬种子质量检验方法与分级标准研究

张应 徐进 李隆云 崔广林 佘跃辉

[摘要]参照《中国农作物种子检验规程》，研究扦样、净度、千粒重、真实性、水分、生活力、相对电导率、发芽等灰毡毛忍冬种子质量检验方法；对38份不同来源的种子做质量检验，采用K均值聚类制定质量分级标准。结果表明：灰毡毛忍冬种子最少试验量为75 g，过20目筛进行净度分析，五百粒法测定千粒重，种子粉碎高恒温（130±2）℃烘干3 h测定水分含量，01%TTC溶液25 ℃避光染色5 h测定生活力，10 g种子在25 ℃超纯水中浸泡12 h测定相对电导率，4 ℃下沙藏层积80 d后置于15 ℃光照纸床进行发芽试验；不同来源种子按质量分为3个等级，初步制定了种子质量分级标准。生产上建议使用Ⅰ级和Ⅱ级种子。

[关键词]灰毡毛忍冬；种子；质量检验；分级标准

[Abstract] Referring to the rules for agricultural seed testing （GB/T 35431995） issued by China， the test of sampling， purity， thousand seed weight， moisture， viability， relative conductivity and germination rate had been studied for seed quality test methods of Lonicera macranthoides. The seed quality from 38 different collection areas was measured to establish quality classification standard by Kmeans clustering The results showed that at least 75 g seeds should be sampled， and passed 20mesh sieve for purity analysisThe 500seed method used to measure thousand seed weight The moisture was determined by crushed seeds dried in high temperature （130±2 ℃） for 3 hThe viability determined by 25 ℃ 01% TTC stained 5h in dark 10 g seeds soaked in 50 ml ultra pure water in 25 ℃ for 12 hours to determine the relative conductivity The seed by 4 ℃stratification for 80 days were cultured on paper at 15 ℃. Quality of the seeds from different areas was divided into three grades The primary seed quality classification standard was establishedThe I grade and II grade were recommend use in production

[Key words]Lonicera macranthoides； seed； quality test methods； quality classification standard

doi：10.4268/cjcmm20160812

灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides HandMazz为忍冬科忍冬属多年生藤本植物，是我国重要大宗药材山银花的基原植物之一，花蕾含有有机酸、黄酮类、皂苷类等化学成分，具有清热解毒，凉散风寒的功效，社会需求量极高[12]。灰毡毛忍冬生态适应性强、产量高、采摘方便、绿原酸含量高，在重庆、湖南、贵州、四川等地广泛种植[3]。

灰毡毛忍冬实生苗繁育成本低、根系活性强，是采用嫁接技术繁育良种的优质砧木材料，生产上广泛应用[46]。但不同产地和成熟程度的灰毡毛忍冬种子质量差异悬殊，严重制约实生苗的生产，迫切需要建立灰毡毛忍冬种子质量检验和分级标准。目前对灰毡毛忍冬的研究主要集中在化学成分、药材质量、栽培技术等方面，未见种子质量相关研究[2，4，612]。本文开展灰毡毛忍冬种子质量检测方法的研究，测定不同来源灰毡毛忍冬种子质量，初步建立了灰毡毛忍冬种子质量评价体系和分级标准。

1材料与方法

11样品

用于质量检验方法研究的种子，于2014年11月采自重庆市江津区柏林镇东胜村灰毡毛忍冬种植基地。用于质量标准研究的种子，于2014年11月分别采自重庆、四川、湖南、贵州等灰毡毛忍冬主产地，共38份，种子编号和具体产地见表1。所有种子均为浆果采收后揉碎，水冲过滤残渣，自然风干而得，经重庆市重中药研究院李隆云研究员鉴定为灰毡毛忍冬L macranthoides种子。用于发芽试验的种子自然风干后置于4 ℃湿沙中层积80 d。

12种子质量检验方法研究

121扦样参照GB/T 354321995“农作物种子检验规程——扦样”，采用“四分法”扦取初次样品和试验样品。根据灰毡毛忍冬种子的市场流通情况和单次可能交易量，净度分析样品不少于2 500粒种子，送检样品为净度分析样品10倍量。

122净度分析扦样得到的种子过20目筛，筛除小型杂质和果皮，置于种子净度工作台上，将净种子、废种子、果皮和果柄，泥沙以及其他杂质分开并称重，重复3次。

种子净度=[净种子/（净种子+废种子+果皮和果柄+泥沙及其他）]×100%

123千粒重测定采用百粒法、五百粒法和千粒法3种方法对种子重量进行测定。①百粒法：从净种子中随机选取100粒称重，重复8次； ②五百粒法：从净种子中随机选取500粒称重，重复3次； ③从净种子中随机选取1 000粒称重，重复3次。计算出标准差和变异系数。重复间变异系数<40%，测定值有效。

124种子真实性鉴定随机选取100粒灰毡毛忍冬种子，观察种子颜色、形态及表面特征，测量种子的长、宽、厚，记录数据。

125水分测定分别采用低温恒温烘干法和高温恒温烘干法2种方法。

分别称取2份2 g种子，1份直接放入洁净干燥的铝盒中，另1份种子粉碎后放入洁净干燥的铝盒中，磨碎细度为50%以上通过05 mm孔径的金属筛，而留在10 mm筛孔的不超过10%。将铝盒置于（105±2） ℃（低恒温烘干）或者（130±2） ℃（高恒温烘干）恒温烘箱，每隔1 h取出放入干燥器内冷却至室温，称重并记录，测定时样品暴露在空气中的时间应少于2 min。总烘干时间6 h，重复4次。

种子水分=[（烘前试样重-烘后试样重）/烘前试样重]×100%

126生活力测定将种子于（25±1） ℃浸种过夜，沿胚中轴线切成两半。分别用01%，02%，04%，06%，08% TTC溶液，25 ℃避光染色，分别于染色1，2，3，4，5，6，24 h后记录生活力。50个半粒为1个重复，每个处理重复3次。另取50粒不切开种子染色观察。

127相对电导率测定分别将05，10，15 g种子用蒸馏水和重蒸馏水各冲洗2遍，浸泡在50 mL蒸馏水中，置于（25±1） ℃恒温箱中，分别测定初始电导率a1，浸泡2，4，8，12，16，24，32 h时的电导率a2，以及将种子和浸泡液煮沸30min后冷却至室温的电导率a3。每个处理设3个重复。

相对电导率=（a2-a1）/（a3-a1）×100%

128发芽试验种子在4 ℃条件下沙藏沉积80 d后，15 ℃光照恒温纸床培养，每重复60粒种子，3次重复，置床后第4天为首次计数时间，第23天为末次计数时间。以芽长为种子长度的1/2为萌发标准。

发芽率GP =（23 d内正常发芽的种子数/供试种子总数）×100%

发芽势GE=（13 d内正常发芽种子数/供试种子总数）×100%

霉变率MP=（24 d内霉变的种子数/供试种子总数）×100%

发芽指数GI =Σ（Gt/Dt）

式中Gt表示在第t天种子的发芽数，Dt代表相应的发芽天数。

13种子分级标准研究

采用上述研究确定的检验方法，对38份灰毡毛忍冬种子进行净度、千粒重、含水量、生活力、相对电导率、发芽率、发芽势、发芽指数、霉变率共9个指标的测定。使用SPSS 190统计分析软件对数据进行统计描述、相关分析、主成分分析和K均值聚类分析。

2结果与分析

21扦样

采用四分法扦取灰毡毛忍冬种子试样，种子净度分析试验所需试样的最少量为75 g（不少于2 500粒种子），送检样品最少为750 g。

22净度分析

净度分析结果见表2，3次重复种子的增失差均未偏离原始质量的5%，故该方法和程序切实可行。

23千粒重测定

千粒重测定结果见表3，百粒重变异系数最大，达828%，超过允许的变异系数40%，测定值无效。千粒法、五百粒法变异系数分别为163%，260%，均未超过允许的变异系数，测定值有效，所以千粒法和百粒法都可用于灰毡毛忍冬的质量测定，实际操作中，为减少工作量，以五百粒法作为灰毡毛忍冬种子千粒重的测定方法。

24真实性鉴定

灰毡毛忍冬种子为扁近椭圆形或三角状卵形，稍扁，长172～442 mm，宽114～353 mm，厚035～135 mm；种皮革制，种子背面中部有凸起的脊，脊两侧有2条明显的凹沟，腹面脊不明显。顶端稍圆，基部稍尖；表面灰褐色或褐色；种脐位于极轴一端。种子千粒重为1562～4910 g。

25水分测定

不同方法测定的种子水分结果见表4，2因素方差分析表明，测定方法和烘干时间对种子水分的主效应极显著（P=0000，P=0000）。种子整粒低恒温（105±2） ℃烘干4 h后水分含量不发生显著变化，其他处理方法3 h后水分含量不发生显著变化。不同测定方法测定结果差异显著，种子粉碎高恒温（130±2） ℃测得的含水量显著高于其他处理方法。因此，以种子粉碎高恒温（130±2） ℃烘干3 h作为测定灰毡毛忍冬种子含水量的方法。

26生活力测定

不同TTC浓度、染色时间测定的种子生活力结果见表5。01%，02%，04%，06%TTC染色5 h后，08%TTC染色4 h后，染色半粒种子数量无显著增加，且放置24 h后，染色种子数均保持不变。相同染色时间，不同浓度TTC测定的生活力差异显著，染色5 h后，01% TTC测定的结果显著高于其他浓度。整粒种子无法正常染色。因此将01%TTC溶液恒温（25±1） ℃染色5 h作为测定灰毡毛忍冬生活力的方法。

27相对电导率测定

不同质量的种子在（25±1）℃的超纯水中浸泡不同时间的相对电导率测定结果见表6。随着浸泡时间相对电导率呈上升趋势；05 g种子浸泡8 h后相对电导率与12，16，24 h无显著差异，32 h后显著上升；10，15 g种子浸泡12 h后相对电导率无显著上升，32 h显著上升。05 g种子浸泡8 h测定的相对电导率变异系数634%，10，15 g种子浸泡12 h测定的相对电导率变异系数分别为201%，223%。因此，将10 g种子浸泡在50 mL超纯水中12 h的测定相对电导率。

28发芽试验

对灰毡毛忍冬发芽适宜条件的研究另文报道。本研究采用将种子置4 ℃条件下沙藏层积80 d后，15 ℃光照恒温纸床培养，每重复60粒种子，3次重复，首次计数为置床后第4天，末次计数为第23天，统计发芽势的时间为置床后第13天。

29种子质量检验方法

本文从扦样、净度、千粒重、真实性、含水量、生活力、相对电导率、发芽等8个方面对灰毡毛忍冬种子质量检验方法进行了研究，确定了适宜于灰毡毛忍冬质量检验方法，见表7。

210种子分级标准

2101种子质量检测结果根据表7所示的灰毡毛忍冬种子质量检验方法，测定38份种子的净度、含水量、千粒重、生活力、相对电导率、发芽率、发芽势、发芽指数和霉变率共9个质量指标，结果见表8。

2102分级指标的确定对38份种子质量指标的相关分析结果见表9。结果表明：生活力与发芽率、发芽势和霉变率极显著相关，相关系数分别为0641，0518，-0529；相对电导率与发芽率、发芽势、发芽指数、霉变率极显著相关，相关系数分别为-0736，-0628，-0511，0492；且生活力与相对电导率极显著相关，因此生活力、相对电导率均能在一定程度上反应种子的活力，表征种子的发芽潜力，可用于种子质量的快速检验。发芽率与发芽势、发芽指数、霉变率极显著相关，相关系数分别为0838，0601，-0732。

以38份种子的质量检查结果为基础，做主成分分析计算出各主成分的特征向量和贡献率，并根据向量的绝对值将不同质量指标划分到不同的主成分之中，结果见表10。主成分因子1和因子2特征值大于1，累计贡献率达6737%，具有较强的信息代表性，因此可以用这2个主成分因子对种子质量进行概括。决定第一主成分大小的主要是发芽率、发芽势、相对电导率和净度4个性状分量，其中发芽率特征向量达-0903，是灰毡毛忍冬种子分级的最主要指标。决定第二主成分大小的主要是千粒重和含水量。根据相关性分析和主成分分析的结果，结合生产上的实践经验和检验的可操作性，建议使用发芽率、相对电导率、净度、千粒重和含水量5个指标作为质量分级的指标。

2103质量分级标准采用SPSS分析软件对38份灰毡毛忍冬种子发芽率、相对电导率、净度、含水量和千粒重5项指标做K均值聚类分析，最终类中心值见表11。在最终类中心值的基础上，发芽率、净度采用缝小数点取整数法，相对电导率、千粒重、含水量尾数采用0～5或5～10逢05进位取整法，修约后的灰毡毛忍冬种子质量级标准见表12。分级方法采用最低定级原则，即任何一项指标不符合规定标准都不能作为相应等级的合格种子。根据修约后的种子质量标准，38份灰毡毛忍冬种子中，Ⅰ 级种子有9份，Ⅱ 级种子有14份，Ⅲ 级种子有15份。

3结论与讨论

本文开展了对灰毡毛忍冬种子质量检验方法的研究，并对不同产地的灰毡毛忍冬种子质量指标进行检验，通过相关、主成分和聚类分析，确定以发芽率、相对电导率、净度、千粒重和含水量5项指标初步制定了灰毡毛忍冬种子质量分级标准。Ⅰ级和Ⅱ级种子质量较好，能满足灰毡毛忍冬种子生产的基本要求，建议生产上使用。

本文通过相关分析发现TTC法测定的生活力和相对电导率，在一定程度上能反应种子的发芽能力，可用于种子活力的快速检测。千粒重与发芽率和发芽势显著相关，与发芽指数极显著相关，千粒重反应种子贮藏物质的多少，影响种子苗的前期发育，可能对种子活力有一定的影响。净度和含水量与发芽率、发芽势和发芽指数极显著相关，2个指标主要受人为因素影响，与种子生物特性无直接相关性，可能是本研究样品质量差异较大的原因，在数据上发生相关。

主成分分析筛选出发芽率、发芽势、相对电导率、净度、千粒重和含水量6个对灰毡毛忍冬质量影响较大的指标，其中发芽率是最重要的指标。发芽率直接反应种子在田间的出苗率，以其为最重要的质量指标与生产需求相符合。相对电导率用于快速判断种子活力，可作为发芽率的替代指标。一般而言，种子活力越高，膜功能越强大，渗透物越少，相对电导率越低；种子活力越低，细胞膜受到损伤，内容物越容易渗透出来，相对电导率越高[14]。净度是种子交易的依据，含水量决定种子安全贮藏和种子寿命，千粒重反映种子饱满、成熟程度和幼苗长势，3个指标都应作为次重要的质量指标[15]。发芽势与发芽率极显著相关，为了简化工作，减少发芽势指标，最终确定5个指标作为灰毡毛忍冬质量评价的指标。

灰毡毛忍冬种子发芽率很低，一方面与种子生物特性相关，一方面霉菌污染也制约了种子发芽。本实验中发现，种子霉变率在5%～6722%，是影响种子正常发芽的主要因素，通过一定的抑菌处理，可以在一定程度上提高灰毡毛忍冬种子的发芽率。关于灰毡毛忍冬种子发芽过程中的霉菌控制方法，还有待于进一步研究。

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[责任编辑吕冬梅]