氰尿酸诱导孕鼠形成肾结石动物模型的研究

刘迪 吴希庆 萨音白刚 杨建新

1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头 014000；2.内蒙古包钢第三职工医院，内蒙古包头 014000

[摘要] 目的 研究氰尿酸在孕鼠妊娠期内能否形成肾脏结石，探讨氰尿酸对孕鼠生育的影响。 方法 将氰尿酸剂量按50、100、250、400、550、700 mg/（kg×d）灌胃孕鼠，对照组灌入蒸馏水，孕鼠生产后停止灌胃。观察孕鼠的产仔情况，HE染色观察孕鼠的肾脏组织的病理变化。结果 400、700 mg/（kg×d）组孕鼠产仔数量明显低于对照组（P< 0.05）。250、400、550、700 mg/（kg×d）组分别有2、4、5、4只孕鼠在病理切片中可见肾小管、集合管有结石样物质。 结论 妊娠期孕鼠灌胃氰尿酸后，高剂量实验组孕鼠产仔数量受到明显抑制；在病理切片中发现结石样物质，并随着剂量的上升加快成石，成功得到了氰尿酸孕鼠肾结石的模型。

[关键词] 氰尿酸；肾结石；孕鼠模型

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）03（b）-0039-04

Study on the Pregnant Rat Model with Kidney Stones Induced by Cyanuric Acid

LIU Di1， WU Xi-qing2， SAYIN Bai-gang2， YANG Jian-xin2

1.Inner Mongolia University of Science and Technology Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China； 2.Department of Urinary Surgery， the Third Staff Hospital of Baogang Group， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China

[Abstract] Objective To investigate whether cyanuric acid can cause the formation of kidney stones in pregnant rats and explore the effect of cyanuric acid on the fertility in pregnant rats. Methods The pregnant rats in cyanuric acid gavage group were given intragastric administration of cyanuric acid 50， 100， 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d）， respectively， and those in the control group were given intragastric administration of distilled water. The lavage was stopped after production. The litter situation， pathological changes in the kidney tissue by HE staining in the rats were observed. Results The number of litter in the 400， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group was obviously less than that in the control group， respectively （P<0.05）. Pathological section showed that there were 2， 4， 5， 4 pregnant rats with material like stones in the renal tubule and collecting duct respectively in the 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group. Conclusion The litter amount in the pregnant rats group with intragastric administration of large-dose cyanuric acid was significantly reduced. Stone-like material was found in the pathological section， and it fast formed the stone with the increase of the dose of cyanuric acid， so the pregnant rat model with kidney stones induced by cyanuric acid was obtained successfully.

[Key words] Cyanuric acid； Kidney stone； Pregnant rat model

氰尿酸，又名三聚氰酸，是一种在工业上常见的化学物质，其结构与三聚氰胺相似，同时也是生产三聚氰胺过程中必不可少的化工原料，其主要广泛应用于消毒业，并被用来进行游泳池的消毒[1]，但是在2007年韩国及美国宠物食用饲料死亡事件以及我国三鹿牌奶粉事件相继曝光后，三聚氰胺及其结构类似物氰尿酸出现在人们的视野里，在奶粉及动物饲料里添加这类物质目的是提高蛋白质的检测含量，目前国外已有动物实验证明三聚氰胺与氰尿酸联合灌胃老鼠与单独灌服三聚氰胺相比，前者对肾功能的毒性更强，形成泌尿系结石更快[2]。因此，在对三聚氰胺进行深入研究的同时，氰尿酸大鼠尿路结石模型的研究非常有必要，而孕鼠尿路结石模型的研究在预防和治疗氰尿酸尿路结石上更有价值。为探讨氰尿酸对孕鼠生育的影响，该实验于2015年9月开始，同年10月结束，实验动物样本总数84只。

1 试验材料

1.1 研究对象、药物及器材

SPF级Wistar雄性大鼠28只，90日龄；SPF级Wistar雌性大鼠56只，体重（250±20）g，90日龄。大鼠精神状态良好，实验室温度、湿度恒定，12 h明、暗交替，动物可随意获取水及食物，所有实验及护理过程遵循我国制定的实验动物管理条例的指导，并严格遵守动物保护公约及禁止虐待动物公约。大鼠及鼠粮均由北京维通利华动物实验有限公司提供（合格证号：SCXK（京）2012-0001）。氰尿酸（化学纯，含量>98.0%），分子式为C3H3N3O3。生物显微镜：Olympus，日本。

1.2 实验分组

将56只Wistar雌鼠随机分为7组（G0-G6）每组8只，对照组为G0，实验组为G1-G6 ，28只雄鼠随机均分7组，按照雄鼠和雌鼠1：2的比例，将各组的雌鼠和雄鼠随机合笼，每笼雄鼠4只，雌鼠8只，早晚检查阴道栓（为雄鼠精液与雌鼠分泌物混合后风干形成）确定受孕情况。

1.3 造模方法

随机将雌鼠分成G0-G6共7组，每组8只。氰尿酸灌胃组（G1-G6）按剂量50、100、250、400、550、700 mg/（kg·d）灌胃孕鼠，对照组G0灌入蒸馏水，均按每只1 mL/100 g灌胃，孕鼠生产后停止灌胃。氰尿酸的灌胃剂量根据Hodge等给予大鼠灌胃三聚氰酸钠的剂量为参考[3]。对照组及氰尿酸灌胃组的雌鼠在确定妊娠后，按照实验分组分别单独喂养。

1.4 观察指标

1.4.1 孕鼠的一般情况及正常产期产下的仔鼠数量 在开始灌胃后，在保证鼠粮及饮用水充足的情况下每天观察妊娠孕鼠的饮食及饮水量，观察孕鼠白天和夜晚的精神状态；并将正常产期内各组孕鼠产下的仔鼠数量做记录，将各组孕鼠生产出的仔鼠的数值求和后取平均数，再进行比较。

1.4.2 孕鼠肾脏病理变化 孕鼠分娩后乙醚麻醉处死雌鼠，并且在无菌条件下切取肾脏观察，将双肾做成病理切片，在显微镜下对肾脏进行观察。

1.5 统计方法

数据处理时应用SPSS 17.0统计软件，所得数据用均数±标准差（x±s）表示，并采用t检验，计数资料进行χ2检验。

2 实验结果与分析

2.1 妊娠雌鼠的一般情况

实验组Wistar 孕鼠与对照组比较，未出现脱毛、毛发直立以及毛发稀松等现象。G4、G5、G6组与对照组比较表现出了不愿进食、活动少，对周围环境敏感，容易受到惊吓，饮水量增多、尿量增加。

2.2 新生仔鼠的总数及平均数

在成功受孕并存活的52只孕鼠当中，共有47只孕鼠顺利分娩产下仔鼠，各组孕鼠分娩出的仔鼠的数量的总和及平均数见表1，如表所示，在所有实验组中，只有M4、M6组的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠数量与对照组相比显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05） ；其余各组的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠与对照组相比，差异无统计学意义（P >0.05）。

2.3 妊娠雌鼠肾脏病理检测结果

对照组妊娠孕鼠肾脏的外观及大小正常，包膜光滑完整，颜色鲜红，在切开肾脏后未见到肾皮质和肾髓质有明显异常。肾脏的肾乳头、肾盏、肾盂等肾脏解剖结构正常，病理切片示无明显异常，见图1。各组孕鼠发生肾结石的情况见表2，M3-M6组孕鼠在肾小管内发现结石样物质，这些结石样物质沉积在集合管和肾小管中，见图2，部分孕鼠肾脏在皮、髓质交界处偶可见到点、片状出血灶，同时可见上皮细胞肿胀伴有损伤和脱落，肾实质与对照组相比萎缩明显，同时也可见到部分肾小球萎缩，但未见明显的肾间质纤维化等病理表现。

3 讨论

继2004及2007年宠物死亡事件中饲料检测出三聚氰胺后，作为一种新物质——氰尿酸浮出水面，研究发现氰尿酸与三聚氰胺同时添加时，其成石率及肾毒性远远大于单独添加其中一种物质[4]。Hodge等人的研究[3]，通过分别给予大鼠、B6C3F1小鼠高剂量三聚氰酸钠 500～700 mg/kg、2 000～2 200 mg/kg经口灌胃，3个月后在两种鼠的膀胱里找到了结石同时伴有膀胱的上皮细胞增生。Ji等将混合后的三聚氰胺+氰尿酸（63/6.3 mg/kg）经口灌胃实验动物后，发现混合物对肾脏等泌尿系器官的损害远远大于这两种物质的单独作用，并于肾脏内发现结晶样物质[4]；而Stine在给妊娠孕鼠摄入三聚氰胺及氰尿酸后，于孕鼠的羊水中检测到三聚氰胺及氰尿酸，证实了三聚氰胺及氰尿酸能够从动物的母体转移到胎儿，对妊娠期的胎儿产生毒性作用，导致胎儿流产、死胎等[5]。

Chen通过给予大鼠灌胃三聚氰胺氰尿酸盐（1：1）400 mg/kg，12 h后发现近端小管开始变性坏死，48 h后发现大鼠肾脏远端小管扩张并可见少量的黄绿色结晶，推断早期肾功能衰竭可能与三聚氰胺氰尿酸盐堵塞肾小管有关[6]。Bob的研究团队发现肠道中某些种类的克雷伯氏菌例如K.Terrigena可将三聚氰胺分解成氰尿酸，生成的氰尿酸与三聚氰胺相遇后加重了肾脏的损害，并加快了结石的形成[7]，这说明了氰尿酸在成石过程中扮演着重要的角色。Yin等人的研究还发现三聚氰胺及其结构类似物对小鼠脾脏淋巴细胞有一定的毒性作用[8]。

该研究通过给妊娠孕鼠灌胃剂量分别为50～700 mg/（kg×d）的氰尿酸后建立了模型组。在实验研究的过程中，能够发现高剂量组的孕鼠生长较对照组雌鼠发育缓慢，精神状态差，不愿活动，在灌胃的第9天和第11天氰尿酸灌胃组雌鼠死亡3 只，通过对雌鼠的尸体进行解剖后研究发现，雌鼠的胸腔未见积血，未见食管受损或破裂，肾脏内可见充血，打开胃后可见白色粉状食糜，双子宫内可见未发育完全的仔鼠，这说明高浓度氰尿酸的摄入可能限制了妊娠雌鼠的正常活动，抑制了仔鼠的发育，另一项实验数据同样提示与对照组的孕鼠相比，高剂量氰尿酸灌胃组孕鼠分娩出的仔鼠数量明显少于对照组，同时在400 mg/kg、550 mg/kg以及700 mg/kg组的病理切片中发现了结石样结晶，但在700 mg/kg组中的病理切片结石样结晶更加显著，原因可能是被摄入的氰尿酸剂量增加导致通过肾脏排泄的氰尿酸浓度上升，相比较低剂量的组更容易形成结石。另一方面高剂量组与低剂量组相比尿量减少同样也间接提高了结晶的浓度。高剂量氰尿酸摄入动物体内在尿液中出现的结晶需要经肾脏的肾小管排泄，当结晶的量达到一定程度时肾小管的负荷加大，最终可能因为结晶沉积堵塞肾小管甚至损伤肾单位，但摄入氰尿酸后在体内形成的晶体是否对肾单位有毒性，目前还不能肯定。

综上所述，通过该实验得出的结果说明氰尿酸作为三聚氰胺的类似物，对人类的确有一定的危害，需要我们继续对其研究，目前对于三聚氰胺、氰尿酸的成石机制还未完全清楚，该实验通过给妊娠雌鼠灌胃摄入氰尿酸的方法，成功建立了氰尿酸孕鼠尿路结石的模型，为氰尿酸尿路结石合并妊娠的预防和治疗提供实验依据。并且应用氰尿酸建立孕鼠尿路结石动物模型尚属首创，类似动物模型国内外研究较少，通过观察孕鼠的生长及生产情况，对预测氰尿酸对妊娠妇女的影响也同样具有重大意义。

[参考文献]

[1] Dorne JL，Doerge DR，Vandenbroeck M，et al.Recent advance in the risk assessment of melamine and cyanuric acid in animal feed[J].Toxicol Appl Pharmacol，2013，270（3）：218-229.

[2] Kim GH，Kang MJ，Noh K，et al.Nephrotoxic potential and toxicokinetics of melamine combined with cyanuric acid in rats[J].J Toxicol Environ Health A，2014，77（22-24）：1346-1358.

[3] Hodge HC，Panner BJ，Downs WL，et a1.Toxicity of sodium cyanurate[J].Toxicol Appl Pharmacol，1965，7（5）：667-674.

[4] Ji Yeon Son，Yoon Jong Kang，Kyeong Seok Kim，et al.Evaluation of renal toxicity by combination exposure to melamine and cyanuric acid in male sprague-dawley rats[J].Toxicol Res，2014，30（2）：99-107.

[5] Stine CB，Reimschuessel R，Keltner Z，et al.Reproductive toxicity in rats with crystal nephropathy following high doses of oral melamine or cyanuric acid[J].Food Chem Toxicol，2014，68：142-153.

[6] Chen YT，Jiann BP，Wu CH，et al.Kidney stone distribution caused by melamine and cyanuric acid in rats[J].Clin Chim Acta，2014，430：96-103.

[7] Bob Weinhold.Gut bacteria and melamine toxicity[J].Environ Health Perspect，2013，121（5）：149.

[8] Yin RH，Liu J，Li HS，et al.The toxic effects of melamine on spleen lymphocytes with or without cyanuric acid in mice[J].Res Vet Sci，2014，97（3）：505-513.

（收稿日期：2015-12-07）