一个新磷酸酶张力蛋白样同源物亚型的研究

张谢 谭麟 朱杰 尹博伟 李宏

[摘要] 目的 鉴定新发现磷酸酶张力蛋白样同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）亚型的生物活性及潜在的肿瘤抑制作用。 方法 蛋白印迹法、免疫共沉淀法检测各细胞株PTEN、PTEN亚型（upper PTEN，UPP）的表达；细胞转染法转染PTEN、UPP、空载体于HepG2和PC3细胞，细胞增殖法检测PTEN、UPP对各株癌细胞生长情况的影响。 结果 UPP是一种紧密依赖于PTEN而存在的蛋白。UPP不是PTEN蛋白翻译后修饰产物，可能是PTEN蛋白选择性剪接体。与转染空载体相比，转染UPP和PTEN于HepG2和PC3细胞，细胞增殖明显抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 UPP可能是PTEN蛋白选择性剪接产物，可能是一个新的肿瘤抑制因子。

[关键词] 磷酸酶张力蛋白样同源物；肿瘤抑制因子；细胞增殖；蛋白印迹法；选择性剪接体

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）09-0001-04

[Abstract] Objective To identify a new phosphatase and tensin homolog（PTEN） subtype and explore its potential role in tumor suppression. Methods Western blotting， immunoprecipitation were used to detect the expression of PTEN subtype（upper PTEN，UPP） and PTEN in different cell lines. PTEN， UPP and mock-vehicle were transfected to HepG2 and PC3 cell lines， then tested PTEN and UPP's effection on tumor suppression by cell proliferation bioassay. Results The expression of UPP closely depended on the existence of PTEN. UPP was not a post-translational modification product by PTEN， rather than its alternative splicing variant. Compared to cells transfected with empty vector alone， HepG2 and PC3 cells transfected with UPP or PTEN inhibited cell proliferation， and there was statistical significance（P<0.05）. Conclusion UPP might be a alternative splicing variant of PTEN and a new tumor suppressor.

[Key words] Phosphatase and tensin homolog； Tumor suppressor； Cell proliferation； Western blot；Alternative splicing variant

磷酸酶张力蛋白样同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）又被称为多种晚期癌突变基因（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1），是继p53之后又一个重要的肿瘤抑制因子[1-4]。我们通常所指的PTEN是一个含403个氨基酸的蛋白质，具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性[5，6]。自从1997年PTEN被作为肿瘤抑制因子提出以来，人们发现在多种人类肿瘤中存在PTEN的缺失或突变[1-4，7]。目前针对PTEN的癌症治疗和其他疾病的治疗抱有很高期望。

我们和其他实验室发现在各种不同的组织和细胞中存在一个比PTEN大约大15kDa的同源蛋白[8，9]。此蛋白的存在严格依赖于PTEN的表达，且表达丰度和PTEN成正比，我们命其名为UPP（upper PTEN）。研究PTEN基因5'-UTR全序列发现在第513位核糖核苷酸存在一个非常规翻译起始位点CTG，且UPP在N端比PTEN多173氨基酸[8-10]。本实验拟鉴定UPP与PTEN关系，以及UPP潜在肿瘤抑制作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及细胞株

DMEM高糖细胞培养液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、双抗（100 U/mL青霉素，100U/mL链霉素）均购自美国Gibico公司；Anti-Human PTEN（clone 6H2.1）抗体购自美国CASCADE生物公司；α-Actin羊单克隆抗体、GAPDH小鼠单克隆抗体、兔抗人IgG、猴抗羊IgG及羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。A431、Cos-1、LNCaP、NIH3T3、PC3、293T、U2OS、HCT116、MDA-468、HepG2细胞株均购自上海中科院细胞库。MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）细胞株以及pcDNA3.1-PTEN、pcDNA3.1-UPP、空载体质粒由美国纽约斯隆癌症中心赠送。

1.2 细胞培养及转染

A431、Cos-1、LNCaP、PC3、293T、U2OS、HCT116、NIH3T3、MDA-468、HepG2、MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）细胞株用含10%FBS，双抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）的高糖 DM EM培养基，在37℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。2×105细胞/3 mL接种于100 mm培养皿中，等其贴壁长到全皿的80%～90%时收蛋白。

按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将UPP、PTEN质粒和空载体分别转染进入HepG2细胞。转染前1 d，细胞铺板于100 mm培养皿中，使其转染日密度为90%。转染试剂用Opti-MEM无血清培养基稀释，细胞也用Opti-MEM无血清培养基孵育。转染6 h后，转染培养基换成完全培养基包含10%FBS和抗生素。细胞转染48 h后，提取蛋白。

1.3 蛋白印迹法（Western blot）检测

收集对数生长期的各细胞株，分别用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后以5%脱脂牛奶封闭30 min，在1∶1000浓度的Anti-Human PTEN （clone 6H2.1） 抗体及1∶400浓度 α-Actin、GAPDH抗体中室温孵育2 h，TBST洗涤3次以后，1∶2000浓度的兔抗人IgG以及1∶1000猴抗羊IgG、羊抗鼠IgG二抗室温孵育1.5 h，TBST洗涤3次，通过加入BeyoECL Plus显色液于凝胶成像仪器曝光。

1.4 免疫共沉淀（Immunoprecipitation）检测

收集对数生长期的细胞株，同上述细胞裂解后，加入3 μg PTEN抗体，4℃孵育过夜。将预处理的20 μL protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃孵育2 h。免疫沉淀反应后，琼脂糖珠用裂解液清洗3次，PBS清洗1次，SDS-PAGE分离，western blot分析。

1.5 细胞增殖检测

UPP、PTEN和空载体转染 HepG2、PC3细胞，G418筛选数周后获得稳定表达细胞。将2×105个稳定表达细胞种在细胞培养皿中，每种表达细胞各种15个培养皿。从第2天开始每天取3个培养皿用胰蛋白酶消化收集细胞、计数取平均值，连续5 d。所得平均值以天为横坐标制作生长曲线，通过比较各种相应质粒转染的细胞生长曲线判断UPP、PTEN对细胞生长的影响。

1.6 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UPP是一种紧密依赖于PTEN而存在的蛋白

利用PTEN特异性抗体并借助免疫共沉淀和蛋白免疫印迹法，结果显示在A431、Cos-1、NIH3T3、293T、U2OS、HCT116、MEF（PTEN+/+）细胞中存在一个比PTEN约大15kDa的同源蛋白，此蛋白的存在严格依赖于PTEN的表达，且表达丰度和PTEN成正比。其中U2OS细胞存在UPP蛋白，但是表达量低。而LNCaP、PC3、MEF（PTEN-/-）细胞中UPP和PTEN均不表达（图1）。

2.2 UPP不是PTEN蛋白翻译后修饰产物

根据UPP分子量的大小，我们猜测了几种可能的翻译后修饰，如单泛素化、SUMO修饰、Nedd8修饰、ISG15修饰，并加以验证。在293T细胞中应用免疫沉淀法结果显示UPP不表达，提示UPP不是PTEN基因翻译后修饰产物（图2）。

2.3 UPP可能是PTEN蛋白选择性剪接产物

为了进一步确认UPP与PTEN的关系，我们转染C-末端HA-，和N-末端 GFP-的PTEN cDNA于COS-1细胞，使COS-1细胞过度表达PTEN，western blot结果显示PTEN表达量增多，但是不能检测到UPP（图3）。

0.1 μg/mL多西环素诱导PTEN缺失的MDA-468细胞，使其PTEN过表达，western blot结果显示，PTEN随着诱导时间表达量增多，但是仍无法检测到UPP表达（图4），以上结果说明UPP很可能是PTEN基因选择性剪接产物。

2.4 UPP可抑制癌细胞的生长

UPP、PTEN和空载体转染 HepG2细胞，检测细胞增殖数。结果显示，转染后第1天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（2.97±0.36）×105、（3.03±0.31）×105、（2.97±0.12）×105，各组间差异无统计学意义（F=0.17，P=0.85）。转染后第2天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（4.03±0.57）×105、（4.27±0.68）×105、（6.33±1.03）×105，各组间差异有统计学意义（F=7.84，P=0.02）；转染后第3天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（7.23±0.96）×105、（6.57±0.68）×105、（11.03±1.80）×105，各组间差异有统计学意义（F=11.29，P=0.01）；转染后第4天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（12.07±1.77）×105、（11.27±1.68）×105、（18.07±2.52）×105，各组间差异有统计学意义（F=10.13，P=0.01）（图5）。

UPP、PTEN和空载体转染PC3细胞，检测细胞增殖数，结果显示，转染后第1天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（2.99±0.30）×105、（2.75±0.42）×105、（4.18±0.67）×105，各组间差异有统计学意义（F=7.52，P=0.02）。转染后第2天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（3.97±0.60）×105、（4.11±0.66）×105、（6.53±0.55）×105，各组间差异有统计学意义（F=17.06，P<0.01）；转染后第3天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（6.48±0.40）×105、（6.56±0.53）×105、（9.97±0.50）×105，各组间差异有高度统计学意义（F=52.23，P<0.01）；转染后第4天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（10.01±0.78）×105、（9.38±0.58）×105、（15.26±0.48）×105，各组间差异有统计学意义（F=79.92，P<0.01）（图6）。

3 讨论

PTEN作为继p53之后又一个重要的肿瘤抑制因子，学者针对其癌症治疗和其他疾病的治疗抱有很高期望。在针对PTEN的抗癌药物开发过程中，PTEN的调控是国内外研究的一个热点。已知的PTEN调控方式包括氧化、乙酰化、磷酸化、泛素化等[11-14]。其中磷酸化被研究得最多。普遍存在的蛋白激酶CK2能磷酸化PTEN蛋白的C端Ser/Thr残基[15]。PTEN去磷酸化后，其羟基端C2结构域外露，有助于PTEN实现膜转移，进而发挥其脂质磷酸酶的功能，抑制PI3K-AKT信号通路[16-18]。去磷酸化后的PTEN相对不稳定，在执行完功能后通常通过泛素-蛋白酶体途径被降解掉，但是CK2磷酸化的对象广泛，虽然通过抑制CK2能够激活PTEN，但因为其他CK2底物也受影响，副作用大[19]。

PTEN另一个被重点研究的翻译后修饰是泛素化，泛素化后的PTEN经由蛋白酶体降解[20，21]。临床显示很多癌症样本中的PTEN泛素化酶水平偏高，说明泛素化介导的PTEN降解可能是癌症发生的一个重要原因[20-22]。有趣的是，PTEN泛素化不仅导致它的降解。除了常见的多泛素化修饰PTEN还可被单泛素化修饰。Pier Paolo Pandolfi 实验室报道PTEN的单泛素化帮助PTEN实现细胞核转运[22]。临床上，从Cowden syndrome患者中发现的PTEN突变体K13E和K289E（两个重要的泛素化位点）虽然保留完整的脂质磷酸酶活性，却因为不能被单泛素化，无法转运入核行使抑癌功能[23]。这种单泛素化和多泛素化的矛盾给以PTEN泛素化酶为靶点开发癌症新药物带来困惑。

利用多种PTEN特异性抗体并借助蛋白免疫印迹法，我们研究显示在各种不同的组织和细胞中存在一个比PTEN大约大15kDa的同源蛋白——UPP。根据UPP分子量的大小，我们猜测了几种可能的翻译后修饰，如单泛素化、SUMO修饰、Nedd8修饰、ISG15修饰，并加以验证。这几种可能都被一一排除。用PTEN的cDNA转染细胞瞬间表达或在PTEN缺失细胞中长时间诱导PTEN的表达不能产生UPP，说明UPP很可能是PTEN基因转录选择性剪接产生的同源蛋白。

Hopkins等[9]是最早报道关于PTEN的亚基，他们将其命名为PTEN-Long，其具有膜脂质磷酸酶渗透性，由细胞分泌，并能进入其他细胞[9]。PTEN-Long的变异翻译起始于上游519bp位点的CUG，N端比PTEN多173个氨基酸，与我们实验室发现的UPP一样。研究显示PTEN-Long与PTEN一样可以通过调控PI3K-AKT途径诱导肿瘤细胞凋亡。之后Liang等[24]又发现一个PTEN亚基，命名为PTENα，其位于线粒体，与PTEN一起调控线粒体能量代谢。PTENα也是另一种翻译剪接体，但是其翻译也起源于上游一个非常规翻译密码CUG，其N段比PTEN多了一个173氨基酸（人类）或者169个氨基酸（小家鼠类）。但是PTEN-Long和PTENα调控的是两个不同的生物学途径，故他们可能是两个不同的PTEN亚基。

转染UPP于HepG2肝癌细胞可抑制其增殖，说明UPP抑制癌细胞生长。通常认为通过腺病毒将PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者体内，可以抑制因PI3K-AKT通路过于活跃导致的癌症[25]。但是，越来越多的临床报道显示腺病毒介导的基因治疗存在安全隐患，接受基因治疗的患者并没有像所期望的那样从癌症中康复，有相当一部分患者出现了由腺病毒导致的各类副作用包括新的癌症。新发现的UPP蛋白可能可以规避以PTEN基因治疗带来的副作用，为针对UPP设计治疗癌症和其他PTEN相关疾病的新方法提供依据。

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（收稿日期：2015-12-11）