过度激活的Rho/ROCK通路介导的心肌缺血再灌注损伤及贝那普利的改善作用

刘晓波 顾靖华 许骥 陈新 何佳 陈海庭 陈锐勇

[摘要] 目的 该研究探索过度激活的Rho/ROCK信号通路在缺血再灌注损伤中的参与机制及贝那普利的改善作用。 方法 SD大鼠随机分为4组：假手术组、缺血再灌注组、Y27632组和贝那普利组。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎法复制心肌缺血再灌注模型，Y27632组和贝那普利组分别给予对应药物灌胃治疗。分析各组血清中MDA、SOD、GSHpx、Rho/ROCK、MMP2/9及Bax/Bcl2和Caspase3/9的表达。结果 模型组血清MDA水平明显增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明显降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表达明显增强（0.25→0.68）。Y27632和贝那普利组大鼠的上述异常得到显著的改善。结论 贝那普利通过抑制过度激活的Rho/ROCK、激活的细胞凋亡信号通路、改善细胞外基质降解与重构发挥保护缺血再灌注大鼠心肌损伤的作用。

[关键词] Rho/ROCK通路；缺血再灌注；心肌损伤；贝那普利；细胞凋亡

[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）03（c）-0117-04

Participation Mechanism of Excessively Activated Rho/ROCK Signaling Pathway in Cardiac Reperfusion Injury and Improvement Effect of Benazepril

LIU Xiao-bo， GU Jing-hua， XU Ji， CHEN Xin， HE Jia， CHEN Hai-ting， CHEN Rui-yong

Diving Medical Research Laboratory，Naval Medical Research Institute of PLA， Shanghai， 200433 China

[Abstract] Objective To study the participation mechanism of excessively activated Rho/ROCK signaling pathway in cardiac reperfusion injury and improvement effect of benazepril. Methods The SD rats were randomly divided into 4 groups， namely sham operation group， ischemic reperfusion group， Y27632 group and benazepril group， the cardiac reperfusion injury model was copied by ligating the left anterior descending coronary artery in rats， the Y27632 group and benazepril group were respectively treated with corresponding drug gavage， the expressions of MDA， SOD， GSHpx， Rho/ROCK， MMP2/9， Bax/Bcl2 and Caspase3/9 in serum of all groups were analyzed. Results The serum NDA level in the model group obviously increased （15.6→24.1 μg/mL）， but the SOD （83.1→34.6 U/mL） level obviously decreased， the expressions of Rho/ROCK （0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）， MMP2/9 （0.28→0.60；0.27→0.63） and Caspase9 were obviously enhanced （0.25→0.68）， the above abnormalities in the Y27632 group and benazepril group were obviously improved. Conclusion Benazepril plays a protection role in rats with cardiac reperfusion injury by suppressing the excessively activated Rho/ROCK， activated cell apoptosis signaling pathway and improving extracellular matrix degradation and reconstruction.

[Key words] Rho/ROCK signaling pathway； Ischemia reperfusion； Myocardial injury； Benazepril； Apoptosis

缺血再灌注损伤即在一定条件下机体恢复血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象[1-3]。缺血再灌注可引起机体多种器官的损伤，尤其是心肌组织，但对其损伤的确切机制尚未完全阐明。Rho/ROCK（Ras homologue/Rho Associate Kinase）信号通路机体内存在的一种与细胞的生长、增殖和分化有关的信号通路，广泛参与机体的多种病理及生理过程[4-5]。Rho/ROCK信号通路主要由Rho蛋白、ROCK1和ROCK2蛋白组成，通过上调下游系列蛋白发挥作用[6]。研究共使用SD大鼠24只，自2013年5月—2014年12月在该单位实验中心完成。该研究探索过度激活的Rho/ROCK信号通路在缺血再灌注损伤中的参与机制及贝那普利的改善作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

24只8周龄SD大鼠购自浙江省实验动物中心，雌性不拘，体重220～240 g，许可证号SZXK（浙）20080033，动物于（55±5）%湿度，（20±2）℃条件下给予标准饲料适应性饲养1周，自由饮食；Y27632、贝那普利均购自美国Sigma Aldrich公司；RhoA、ROCK1/2、MMP2/9及Caspase3/9一抗均购自美国Santa Cruz；二抗及显色试剂盒购自武汉博士德公司；其余试剂均为市售分析纯。所有操作均符合上海市实验动物管理条例。

1.2 缺血再灌注大鼠模型复制

所有大鼠适应性饲养一周，自由饮食。24只SD大鼠随机分为4组：假手术组、缺血再灌注组、Y27632组及贝那普利组（n=6）。采用冠状动脉左前降支结扎大鼠建立大鼠心肌缺血再灌注模型：结扎大鼠冠状动脉左前降支前0.5 h从右腔静脉注射生理盐水，结扎左前降支0.5 h后松开并再行灌注2 h。假手术组仅穿线但不结扎冠状动脉左前降支。Y2632组（20 mg/kg）和贝那普利组（20 mg/kg）于结扎前0.5 h于右腔静脉注射相应药物。造模结束后逐层缝合肌肉、皮肤，大鼠手术切口处注射少许青霉素注射液防止手术感染。

1.3 生化指标及免疫印迹法

血清MDA、SOD及GSHpx试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。所有实验操作均严格按照说明书进行。免疫印迹法参照以往报道方法进行[5]。

1.4 统计方法

数据统计应用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并采用 t 检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注大鼠异常的MDA、SOD及GSHpx

研究发现，缺血再灌注大鼠血清MDA水平明显增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD水平明显降低（83.1→34.6U/mL）（P=0.006），而贝那普利和Y27632对上述异常有显著的改善作用（P=0.008），见图1。

2.2 缺血再灌注大鼠异常表达的RhoA及ROCK1/2

研究发现，缺血再灌注大鼠心肌组织RhoA（0.18→0.64）及ROCK1/2（0.19→0.69；0.16→0.65）水平明显增高（P=0.004，P=0.002，P=0.003），而贝那普利和Y27632对上述异常有显著的改善作用（P=0.005，P=0.003，P=0.007），见图2。

2.3 缺血再灌注大鼠异常表达的MMP2/9

2.4 缺血再灌注大鼠异常表达的Caspase3/9

3 讨论

缺血再灌注存在于多种病理过程中，会对机体多种组织造成严重的损伤，尤其是心肌组织。心肌缺血再灌注损伤表现为心肌组织中心肌细胞坏死、细胞内存在过多氧自由基，甚至发生细胞凋亡，并导致心律失常或心室收缩力减弱[7]。该研究探索过度激活的Rho/ROCK信号通路在缺血再灌注损伤中的参与机制及贝那普利的改善作用是发现模型组血清MDA水平明显增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明显降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表达明显增强（0.25→0.68）。Y27632和贝那普利组大鼠的上述异常得到显著的改善。因此，贝那普利通过抑制过度激活的Rho/ROCK、激活的细胞凋亡信号通路改善缺血再灌注大鼠心肌损伤。

ROCK是与细胞凋亡相关的激酶，参与调解细胞的多种生理功能，如增殖、分化、凋亡、收缩及粘附等。在心血管系统中，RhoA/ROCK通路也与血管再狭窄、肺动脉高压、心肌肥厚、高血压以及心力衰竭等病理过程密切相关。研究证实，压力负荷可以促进心肌肥厚的发生及发展过程，且此过程中存在RhoA/ROCK相关蛋白的上调表达（RhoA：126.2%；ROCK1：108.8%），而药物干预可以通过抑制上调的RhoA/ROCK表达（RhoA：123.5%；ROCK1：105.1%）改善心肌肥厚的进展[8]。与上述研究结论相似，该研究也发现冠状动脉前降支结扎复制的缺血再灌注心肌损伤模型中心肌组织RhoA及ROCK1/2的表达明显增强（RhoA：0.18→0.64；ROCK1：0.19→0.69；ROCK：0.16→0.65），而内那普利可以显著抑制该通路的异常发挥抑制心肌损伤的作用。该研究中也证实，冠状动脉前降支结扎复制的缺血再灌注心肌损伤模型中心肌组织中促凋亡蛋白Caspase9表达明显增强，而内那普利可以通过抑制ROCK通路抑制心肌细胞的凋亡。但是，该研究中所采用的Y27632为特异性的ROCK蛋白抑制剂，而对Rho蛋白表达无明显的调控作用。在以后的研究中将采用Rho蛋白特异性抑制剂进行干预，进一步分析Rho/ROCK通路中各个蛋白在此病理过程中的具体作用，为临床精准治疗提供参考。

因此，贝那普利通过抑制过度激活的Rho/ROCK、激活的细胞凋亡信号通路、改善细胞外基质降解与重构发挥缺血再灌注大鼠心肌损伤的保护作用。

[参考文献]

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[5] 王保奇，殷子杰，程志清. 三参饮对病毒性心肌炎慢性期Rho/Rock信号通路的作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2014（6）：140-144.

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