根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得

李三和　韩光明　闸雯俊　刘凯　胡刚　游艾青

摘要：以水稻（Oryza sativa L.）籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚为材料，以携带有双元载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105为载体进行抗飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遗传转化，共获得515棵再生植株，包括198株Bph14转基因植株、72株Bphi008A转基因植株和245株Osz！转基因植株。PCR检测结果表明，获得的515株再生植株中，有244株阳性转基因植株，3个不同抗褐飞虱基因中，转Bvh14基因的再生苗阳性率最高，增加筛选次数能有效减少转化所得的假阳性植株。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导转化；抗褐飞虱基因

中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2392-04

近年来，褐飞虱迁入中国的虫量大，由于目前大多数水稻（Orvza sativa L.）品种不抗虫，尤其是一些主要的杂交稻品种，对褐飞虱等虫害还有“超感虫性”（hyper-susceptibility）。目前，水稻褐飞虱已经成为一种爆发力强、对水稻危害性极大的虫害。由于褐飞虱的危害多发生在水稻成熟灌浆期，此时若大量使用杀虫剂，对水稻的污染会非常严重，这也是中国水稻生产中迫切需要解决的重要问题。研究证明，利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中经济有效的方法。通过转基因技术与常规育种技术相结合培育抗褐飞虱水稻品种，有效控制褐飞虱的发生与危害，可确保中国水稻生产持续稳定发展和国家粮食安全。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化系统是对天然载体转化系统的一种模仿，已在水稻转基因育种及功能基因组研究中被广泛应用，1994年以后，由于技术上的突破。相继在不同水稻品种中获得成功，转化效率也大大提高，如粳稻的转化率一般在30%左右，最高可达到64.6%。本研究以育种上应用的典型籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S为材料，利用根癌农杆菌介导法对褐飞虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl进行遗传转化，目的是通过3个抗褐飞虱基因的导入，探索水稻抗褐飞虱育种的新途径，以期提高其产量和品质。

1 材料与方法

1.1 植物受体材料

两系恢复系M5274、晚粳稻不育系N55S，由湖北省农业科学院粮食作物研究所选育。

1.2 农杆菌菌株与质粒载体

根癌农杆菌菌株EHA105，质粒PCAMBIA1300的T-DNA区含有潮霉素抗性基因（Hyg^r），抗褐飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武汉大学提供。

1.3 材料的处理及接种

选取健康饱满无病斑的成熟种子，除去颖壳，用75%乙醇浸泡1min，然后将种子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中，搅拌10-12min。灭菌后用无菌水冲洗4-5次，最后将种子取出置于无菌滤纸上，待种子表面干燥后，以平摆法将其接种于各自不同的诱导培养基上，每瓶12-14粒。每个品种接30瓶。

1.4 水稻组织培养

粳稻组织培养培养基见表1，籼稻组织培养基为LY培养基，购自武汉博远生物科技有限公司。将成熟胚表面按“1.3”的方法消毒后接种于愈伤组织的诱导培养基上。

1.5 农杆菌的培养及其介导的水稻转化

根癌农杆菌的培养及其介导的转化过程参照Hiei等的方法。

1）划菌：取转化后经检测有所需载体的农杆菌保存菌液5-10μL，至YEB（加入浓度为100mg/L的卡那霉素）的固体培养基上涂板，30℃黑暗培养，直到长出单菌落。将单菌落二次划线培养农杆菌24-36h，刮菌体于悬菌培养基中，30℃180r/min摇菌3-4h，调整菌液OD_600nm至所需值。

2）侵染：用悬浮培养基稀释菌液，直到OD_600nm为0.1-0.9，将含农杆菌菌液倒入已放好愈伤的培养瓶中，根据菌液浓度在30℃摇床上侵染5-30min。倒掉菌液，用灭菌的滤纸将菌液吸干，用镊子把愈伤组织转移到共培养培养基上，20℃黑暗培养48-72h。

3）洗菌：把共培养基上的愈伤组织转入灭菌三角瓶中，用无菌水清洗5-6次，直到水不再浑浊。然后加入灭菌水（含有500mg/L头孢霉素）120r/min28℃摇菌15-20min。

4）晾干愈伤：把水倒掉，把愈伤组织转移到放有灭菌滤纸的培养皿中，在超净台吹40-50min。

5）把晾干的愈伤组织转移到筛选培养基上进行筛选培养，分别进行一轮和两轮筛选培养。每轮25d左右，比较筛选的有效性。

6）把筛选出的抗性愈伤组织进行预分化、分化和生根培养。

1.6 转基因水稻植株的PCR鉴定

1.6.1 转基因植株总DNA的提取 按CTAB法从水稻新鲜叶片中提取总DNA。

1.6.2 潮霉索抗性基因的PCR检测 根据转化载体中Hyg^r基因DNA片段的序列设计引物进行PCR扩增，PCR引物为Primer1（5'-GCCTGACCTATTG-CATCTCC-3'）、Primer2（5'-CCTCGCTCCAGTCAAT-GACC-3'）。PCR反应体系：总体系为20txL，DNA模板50ng，10xbuffer2，0μL，2mmol/L dNTP1.5μL，25mmol/L MgCl₂2.0μL，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U。加灭菌ddH₂O至20μL。PCR反应程序：94℃变性3min：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环：72℃延伸5min。

1.6.3 目的基因Bph14的检测 根据Bph14基因序列设计引物，检测水稻的基因组DNA中是否含有该基因。PCR扩增引物：正向5-GGCAGATCATCACCAACTCC-3，反向5-GGCGACTGCGAATGCTAT-3，产物大小为566bp。PCR反应体系：总体系为20μL，DNA模板50ng，10×buffer2.0×L。2mmol/LdNTP1，5μL，25mmol/LMgCl₂2.0×L，10μmol/L引物各0.4μL，Taq酶1U，加灭菌ddH₂O至20μL。PCR反应程序：94℃。变性5min：94℃，变性1min。58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环：72℃延伸5min。

2 结果与分析

2.1 粳稻N55s转基因植株的获得

根癌农杆菌介导粳型稻N55S只进行第一轮筛选后，分化生根，获得转Bph14基因的总苗数为40株，阳性株数21株，阳性植株比率为52.5%：获得转Bphi008A基因的再生苗16株，其中抗性植株5株，阳性植株比率为31.3%：获得转Osgl基因的再生苗35株，其中阳性植株12株。阳性植株比率为34.3%。进行两轮筛选后。分化生根。获得转Bph14基因总苗数为45株，其中阳性植株27株，阳性植株比率为60.0%：获得转Bphi008A基因总苗数22株，其中阳性株数为8株，阳性植株比率为36.4%：获得转Osgl基因总苗数94株，其中阳性植株36株，阳性植株比率为38v3%（表2）。根癌农杆菌介导粳型稻N55S转抗褐飞虱基因的结果表明，不论是一轮筛选还是两轮筛选，Bph14基因转化效率最高，Bphi008A基因转化效率最低，Osgl基因转化效率居中，但Bphi008A基因与Osgl基因转化效率相差不大。

2.2 籼稻M5274转基因植株的获得

根癌农杆菌介导籼型稻M5274经第一轮筛选后，分化生根，获得转Bph14基因总苗数46株，阳性株数35株，阳性植株比率为76.1%：获得转Bphi008A基因26株转基因苗，其中抗性植株2株，阳性植株比率为7.7%；获得转Osgl基因19株转基因苗，阳性植株6株，阳性植株比率为31.6%。第二轮筛选后，获得转Bph14基因再生苗数为67株，其中阳性植株55株。阳性植株比率为82.1%：获得转Bphi008A基因再生苗数8株，其中阳性株数为2株。阳性植株比率为25.0%：获得转Osgl基因再生苗97株，其中阳性植株35株，阳性植株比率为36.1%（表3）。与前面结果类似，根癌农杆菌介导籼型稻M5274转抗褐飞虱基因试验中，增加筛选可以提高获得阳性再生苗的比例，且Bph14基因转化效率最高。其次是Osgl基因，Bphi008A基因转化效率最低。

2.3 PCR检测

为了获得转基因的直接证据，提取了转基因植株的叶片总DNA，除了进行了PCR扩增检测潮霉索抗性基因Hyg^r外。部分转化Bph14基因的材料还检测了目的基因。结果表明，转基因植株中均能扩增到566bp潮霉素抗性基因Hyg^dr的DNA条带，呈阳性反应，而未转基因植株则没有扩增到DNA条带（图1），从而证明目的基因已整合到转基因植株中。

3 讨论

农杆菌介导的基因转化技术是水稻基因转化的首选方式。农杆菌介导转化方法的优点是转化效率高。转基因重排比例少，插入拷贝数少。单拷贝数植株比例高。影响农杆菌转化效率的因素有菌株类型、水稻基因类型、培养基成分组成、组织培养条件等。不同水稻品种需要不同的转化条件，愈伤组织经过多代培养后易产生体细胞突变，不利于转化体的筛选：同时，多代培养后愈伤组织衰老死亡，转化效率降低。作者曾将未经继代培养的愈伤组织进行转化，发现转化效率也很低，这说明细胞的周期状态影响转化效率。已有研究表明，当愈伤组织处于细胞周期S期和G2期的比例最高时，转化效率最高，S期是细胞DNA复制期。此时转化有利于转入的T-DNA链转变成双链，增加遗传和整合的稳定性。黄红梅等研究结果表明，愈伤组织经过继代培养6-7d后转化率高达95%，本研究通过已优化的粳稻培养基体系和籼稻培养基试剂盒分别对粳稻N55S和籼稻M5274进行抗褐飞虱基因根癌农杆菌介导的遗传转化，其中粳稻和籼稻转化效率分别为42.5%和45.5%，但3种抗褐飞虱基因对粳稻和籼稻的转化效率不同，其中Bph14最高，Bphi008A最低，Osgl居中。粳稻和籼稻各自不同时期转化效率的差异可能和组织培养条件和抗褐飞虱基因有密切关系，有待进一步研究。