HPLC测定砷对星形胶质细胞内GSH含量的影响

焦雪鑫,高岚岳,方　莹,霍韬光,张颖花,吴　辉,姜　泓*

(1.中国医科大学 公共卫生学院, 辽宁 沈阳110122;　2.辽宁中医药大学 药学院, 辽宁 大连 116600)



HPLC测定砷对星形胶质细胞内GSH含量的影响

焦雪鑫1,高岚岳1,方莹2,霍韬光1,张颖花1,吴辉1,姜泓1*

(1.中国医科大学 公共卫生学院, 辽宁 沈阳110122;2.辽宁中医药大学 药学院, 辽宁 大连 116600)

摘要：建立高效液相色谱法(HPLC)检测星形胶质细胞(AC)内谷胱甘肽(GSH)含量的测定方法，探讨急性砷暴露对AC内GSH水平的影响，为砷对神经系统损伤机制研究提供检测手段. 结果表明，该方法准确、灵敏、可靠. AC内GSH含量随急性砷暴露剂量增加而逐渐升高.

关键词：高效液相色谱法；星形胶质细胞；谷胱甘肽；砷

砷是自然界中广泛存在的类金属物质. 近年来，随着对地方性砷中毒研究的深入，砷对中枢神经系统的影响及作用机制也逐渐受到关注[1]. 国内外流行病学调查均发现长期砷暴露可影响儿童的智力发育[2-4]；动物实验研究也表明，砷可通过血脑屏障进入并蓄积在脑内，产生神经系统毒性[5-8]，但其毒性作用机制目前尚未完全的阐明. 星形胶质细胞(Astrocytes，AC)是脑内含量最多的细胞，具有维持细胞内外环境、参与突触间隙神经递质的清除与代谢等功能，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是细胞内重要的抗氧化和解毒物质之一，是维持细胞正常功能的自由基清除剂，对神经系统具有重要的保护作用. 本研究以体外培养Wistar 胎大鼠的AC为研究对象，采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)测定AC内GSH的含量，探讨急性砷暴露对AC内GSH水平的影响，为砷对神经系统毒性损伤机制研究提供检测手段.

1实验部分

1.1仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括G1312C二元泵，G1314F紫外检测器，色谱数据工作站；3K-18超速冷冻离心机(日本日立公司)；MB100-2A微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)；ER-182A全自动电子天平(十万分之一)(日本A&D公司)；超净工作台(上海苏净安泰公司)；Thermo二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司)，CKX31倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，Easypure纯水系统(美国Barnstead公司).

GSH标准品(美国Aladdin工业公司)；亚砷酸钠(美国Fluka公司)，DEME培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)；7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(SBD-F)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和三氯乙酸(TCA)均购自美国Sigma公司；乙二胺四乙酸(EDTA)(辽宁沈阳制剂一厂)；甲醇、乙腈均为色谱纯试剂(山东禹王集团)；其他试剂均为分析纯试剂；实验用水均为去离子水；所用玻璃器皿经浓硫酸溶液浸泡24 h，用去离子水洗净，高压灭菌，备用.

1.2色谱条件

色谱柱：Thermo ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(体积比3.5∶96.5，pH 4.5)；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：230 nm；进样量：20 μL.

1.3实验方法

1.3.1AC原代培养及细胞分组与处理

取出生1～3天的Wistar 胎大鼠(由中国医科大学实验动物中心提供)，参照文献[9]的方法培养AC. 将纯化的AC随机分为6组，待细胞形成单层后，分别换成砷浓度为0、50、100、200、400、600 μmol·L-1的培养液，培养4 h后，进行各指标检测.

1.3.2GSH标准品溶液制备

精密称取GSH标准品，去离子水溶解定容，得到5 mmol/L GSH标准品储备液，置于4 ℃冰箱中保存.

1.3.3AC样品制备

长满皿底的细胞经“1.3.1”项下方法处理后，收集细胞，于3 500 g，离心5 min，弃上清，加入RIPA细胞裂解液，4 ℃裂解1 h，12 000 rpm，4 ℃离心15 min，取上清，按BCA试剂盒所述方法进行蛋白测定，其余上清贮存于-80 ℃冰箱待测.

1.4方法学考察

1.4.1标准曲线与检测限

取6批AC混合裂解液100 μL，加入100 μL GSH标准品溶液，得相当于浓度为2、5、10、20、50 μmol·L-1的GSH混合细胞样品，按样品处理方法进行测定，以混合细胞样品的GSH浓度为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得直线的回归方程，即为标准曲线. 检测限为空白的3倍积分面积.

1.4.2精密度与准确度

取混合AC裂解液100 μL，加入100 μL GSH标准溶液，得浓度为5、20、50 μmol·L-1的GSH质控样品(QC)，每一浓度制备6个平行样品，分别每天测定1次连续测定3天，计算日间精密度；同一细胞样品1天内连续测定6次，计算日内精密度；当日的标准曲线计算QC样品的测定浓度，与配制的浓度做对照，求得此方法的准确度.

1.4.3回收率

取QC，每一浓度制备3个平行样本进行分析；另外制备空白样品，即取混合裂解液100 μL，加入100 μL去离子水，以同样的方法测定. 方法回收率=(测得的质控样品浓度-测得的空白样品浓度)/加入的GSH标准溶液浓度.

1.5AC内GSH含量的测定

将-80 ℃保存的细胞样品复温，精密量取标准品溶液和细胞样品各100 μL，分别加入50 μL 12 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和10μL 50 mmol/L TCEP，混匀，于25 ℃还原10 min后，加入1 mmol/L的EDTA 45 μL，混匀后加入1% TCA 45 μL沉淀蛋白，混匀，于10 000 rpm，4 ℃离心10 min. 精密吸取上清液100 μL，加入SBD-F 50 μL 衍生化，混悬5 s，于60 ℃反应1 h，于10 000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，注入HPLC中.

1.6AC形态观察

将纯化的AC接种于6孔板中，按上述“1.3.1”项下方法染毒培养4 h，倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学并摄像.

1.7统计分析

所得数据均以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P<0.05作为检验的显著性差异.

2结果与讨论

2.1色谱条件考察

根据上述色谱条件对样品进行分析，图1给出了空白试剂、GSH标准溶液和细胞样品经SBD-F衍生化后的HPLC色谱图，由图可见，细胞样品中内源性物质及试剂对其测定无干扰，且各组之间的分离度良好，AC内GSH在15 min内均完全分离.

图1　空白(A)、GSH标准品(B)和AC样品(C)的HPLC图Fig.1　HPLC graph of Blank (A), GSH standard (B) and AC sample (C)

名称本底值/(μmol·L-1)加标值/(μmol·L-1)实测值(x±s)准确度(RE/%)日内精密度(RSD/%)日间精密度(RSD/%)回收率/%(x±s)58.27±0.41-2.84.63.195.4±7.6AC3.52022.92±0.79-2.53.55.297.1±4.05052.11±1.33-2.62.62.897.3±2.7

表2　砷暴露AC内GSH含量

注：*与对照组相比较，P<0.05；#与50 μmol·L-1砷染毒组相比较，P<0.05；

&与100 μmol·L-1砷染毒组相比较，P<0.05；+与200 μmol·L-1砷染毒组相比较，P<0.05.

2.2方法学考察

2.2.1标准曲线与检测限

GSH在2～50 μmol·L-1浓度范围内线性关系良好，灵敏度高，回归方程为Y=1.95X+0.469 3(r=0.998 3)，检测限为0.5 μmol/L.

2.2.2精密度、准确度及回收率

由表1可见，GSH衍生物日内、日间精密度RSD均在2.6%～5.2%之间，准确度RE在-15%～15%范围内，AC样品加标回收率在95.4%～97.3%范围内，表明测定AC内GSH的分析方法精密度、准确度良好及回收率较高.

2.3AC内GSH含量的测定

由表2可见，AC经砷暴露4 h后，随着砷浓度的增加，AC内GSH含量呈现逐渐升高的趋势，50、100 μmol·L-1砷组较对照组没有显著性差异(P>0.05)， 200、400、600 μmol·L-1砷组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，其中，200、400、600 μmol·L-1砷组与50 μmol·L-1、100 μmol·L-1砷组比较有显著性差异(P<0.05)；400、600 μmol·L-1砷组与200μmol·L-1砷组比较也有显著性差异(P<0.05).

2.4AC形态观察

图2显示， 经砷暴露4 h的AC，50、100 μmol·L-1砷组细胞形态与对照组比较未见明显改变；但200 μmol·L-1砷处理后，细胞形态发生了明显变化，可见细胞轮廓增强，细胞的折光性变强，细胞产生圆缩和脱落，细胞空隙增大，且随着砷暴露剂量的增加，400、600 μmol·L-1砷组细胞数量明显减少，死细胞大量增加.

2.5讨论

含巯基化合物的测定方法较多，如荧光光度法、比色法和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[10]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[11]等，其中荧光光度法和比色法灵敏度低、特异性差，而HPLC-MS和GC-MS仪器较为昂贵，不能普遍应用. 目前，HPLC较为常用，但采用HPLC测定体外培养细胞内GSH含量的报道较少. 采用HPLC测定GSH需要寻找合适的衍生化试剂，本文对3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(CNBF)和SBD-F两种衍生化试剂进行分别考察，结果发现，二者均可作为GSH测定的衍生化试剂，但氨基类衍生化试剂CNBF较SBD-F灵敏度低，对于GSH含量较高的生物样品有较好的分离度，但对于AC内低含量的GSH测定结果不佳，其分离度和灵敏度较差，因此，本文选用分离度和灵敏度较好的SBD-F作为衍生化试剂，该物质能与硫醇物特异性反应，且其反应稳定，色谱峰良好[12]. 同时，对样品与衍生化试剂的比例进行考察，结果显示，样品与衍生化试剂为2∶1时，与其1∶1时相比较，测定的灵敏度更高且色谱峰较好、回收率较高，与其3∶1时的含量基本一致. 因此，本研究将样品与衍生化试剂的比例定为2∶1. 此外，又对方法中的沉淀蛋白条件进行了优化，结果选用1% TCA作为沉淀蛋白试剂较好.

图2　不同剂量砷暴露AC形态学观察(倒置显微镜，×200)Fig.2　Morphology of AC with different doses of arsenic exposure(inverted microscope, × 200)

砷是亲硫物质，易与巯基结合，而引起含巯基的酶、辅酶和蛋白质生物活性功能的改变[13]. GSH是细胞内丰富的非蛋白巯基，是维持细胞正常功能的自由基清除剂，对神经系统具有重要的保护作用，在毒物解毒过程和抵御过量氧化应激等方面发挥着重要的作用[14]. 本研究结果显示，AC经砷暴露4 h后，当给予200、400、600 μmol·L-1砷暴露后AC内GSH的含量明显升高，但有趣的是，当砷浓度大于200 μmol·L-1后，AC形态发生了明显变化，细胞轮廓、折光性变强，细胞产生圆缩和脱落，且细胞空隙增大，随着砷暴露剂量的增加细胞数量明显减少，死细胞大量增加，说明砷对AC产生了明显的毒性损伤，且其损伤作用随着砷暴露剂量的增加而增加. 截然相反的两个结果，我们推测在急性砷暴露期GSH水平的升高，可能与GSH对AC产生的应激性保护作用和/或与GSH合成的相关酶的参与有关. 调控GSH合成的相关酶是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽转移酶(GST)，其在对砷的解毒代谢和抗氧化中具有十分重要的作用[15-16]. 研究显示，随急性砷暴露剂量的增加，γ-GCS、GR和GST三种合成酶的含量上升，进而诱导GSH的合成增加[17].

3结论

建立的HPLC法适用于检测AC内GSH含量，该方法准确、灵敏、可靠，经急性砷暴露的AC内GSH含量随暴露剂量的增加而升高，细胞形态随其剂量增加发生明显改变且死细胞数大量增加.

参考文献：

[1] 张军, 王艳, 赵凤红, 等. 蛋氨酸对砷暴露小鼠脑砷形态及NO代谢影响[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(9): 1117-1119.

[2] PEREA G, ARAQUE A. Synaptic information processing by astrocytes [J]. Physiol Paris, 2006, 99(2/3): 92-97.

[3] PEREA G, ARAQUE A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses [J]. Science, 2007, 317(5841): 1083-1086.

[4] FELLIN T. Communication between neurons and astrocytes: relevance to the modulation of [J]. Neurochem, 2009, 108(3): 533-544.

[5] JUAREZ-REYES A, JIMENEZCAPDEVILLE. Time course of arsenic species in the brain and liver of mice after oral administration of arsenate [J]. Arch Toxicol, 2009, 83: 557-563.

[6] WANG Y, ZHAO F, JIN Y, et al. Effects of exogenous glutathione on arsenic burden and NO metabolism in brain of mice exposed to arsenite through drinking water [J]. Arch Toxicol, 2011, 85: 177-184.

[7] 霍韬光, 杨卉蕾, 李维凯, 等. 雄黄对大鼠脑组织能量代谢的影响[J]. 化学研究, 2012, 23(1): 53-55.

[8] 张颖花, 高咏, 霍韬光, 等. 利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量[J]. 化学研究, 2013, 24(3): 274-276.

[9] HAMPRECHT B, LÖFFLER F. Primary glial cultures as a model for studying hormone action [J]. Methods Enzymol, 1985(109): 341-345.

[10] HUANG YQ, GD R, JQ L, et al. Use of isotope differential derivatization for simultaneo [J]. Anal Biochem, 2011, 416(2): 159-166.

[11] WARREN JM, DR P, PAWLISZYN J. Assessment of thiol compounds from garlic by auto [J]. J Agric Food Chem, 2013, 61(3): 492-500.

[12] GARCIA A J, APITZ-CASTRO R.Plasma total homocysteine quantification: an improvement of the classical high-performance liquid chromatographic method with fluorescence detection of the thiol-SBD derivatives [J]. J Chromatogr B, 2002, 779(2): 359-363.

[13] 姜泓, 丁敬华, 高双, 等. As(Ⅲ)和As(Ⅴ)与牛血清白蛋白的结合平衡研究[J]. 化学研究, 2008, 19(2):91-93.

[14] 董丹丹, 王欣, 赵朔， 等. 急性砷暴露对小鼠机体谷胱甘肽水平及其调控酶蛋白表达的影响[J]. 环境与健康杂志, 2013, 30(1): 19-23.

[15] SALVEMINI F, FRANZE A, LERVOLINO A, et al. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phophate dehydrogenase expression [J]. Biol Chem, 1999, 274: 2750-2757.

[16] LIU H, LIGHTFOOT R, JL S. Activation of heat shock factor by alkylating agents is trigger [J]. J Biol Chem, 1996, 271: 4805-4812.

[17] 胡宇, 金喜梅, 王国荃, 等. 砷对NIpT3 细胞谷胱甘肽水平、相关酶活性及其基因表达的影响[J]. 环境与职业医学, 2003, 12(6): 396-402.

[责任编辑：任铁钢]

Effect of the contents of GSH in astrocytes exposure to arsenic determined by HPLC

JIAO Xuexin1, GAO Lanyue1, FANG Ying2, HUO Taoguang1, ZHANG Yinghua1,

WU Hui1, JIANG Hong1*

(1.SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,Liaoning,China)

Abstract:A high performance liquid chromatography (HPLC) method was established to detect the contents of glutathione(GSH) and study the effect of acute arsenic exposure on the levels of GSH in astrocytes(AC). The research provides the detection method for investigation the mechanism of arsenic induced injury on the nervous system. The results showed that the method was accurate, sensitive and reliable. After acute arsenic exposure, the content of GSH in astrocytes gradually increased with an increasing dose of arsenic.

Keywords:high performance liquid chromatography; astrocyte; glutathione; arsenic

文章编号：1008-1011(2016)02-0206-05

中图分类号：O657.7

文献标志码：A

作者简介：焦雪鑫 (1989-),女,硕士生,研究方向为含重金属矿物药毒作用机制研究. *通讯联系人, E-mail: jianghong@mail.cmu.edu.cn.

基金项目：国家自然科学基金(81473417；81403066).

收稿日期：2015-12-25.