P-糖蛋白抑制剂在PET显像中的应用研究

何燕 苏晋 郑晓霞 温莉 孙树兰

251700，山东省滨州市中心医院放射科

·论著·

P-糖蛋白抑制剂在PET显像中的应用研究

何燕 苏晋 郑晓霞 温莉 孙树兰

251700，山东省滨州市中心医院放射科

目的 探讨11C-GF120918作为PET显像探针对人体P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）功能的检测及其意义。方法 化学合成11C-GF120918；给小鼠注射11C-GF120918，使用自动伽玛粒子计数管测定不同时间、不同剂量、小鼠各组织器官中11C-GF120918的放射性强度；并使用高效液相色谱监测30 min后小鼠脑部和血液中11C-GF120918代谢情况；P-gp基因敲除组、BCRP基因敲除组、P-gp/BCRP基因敲除组和野生型对照组小鼠分别注射11C-GF120918，进行PET显像，实时监测小鼠大脑中的11C-GF120918放射强度变化。结果11C-GF120918在小鼠各个组织器官中均有广泛分布，相对于正常小鼠差异有统计学意义（χ2=8．14，P＜0．05）；且11CGF120918代谢稳定，注射后30 min，在大脑和血液中仍有（99．3±0．5）%和（83．2±3．5）%未被代谢，具有较好的生物化学稳定性和辐射稳定性。P-gp/BCRP基因敲除组小鼠大脑中11C-GF120918放射性强度是野生型对照组的9倍（χ2=7．69，P＜0．05），而BCRP基因敲除组小鼠大脑中放射性强度是野生型对照组的3倍（χ2=8．24，P＜0．05），差异有统计学意义。且11C-GF120918标记效果比较稳定。结论 使用11C-GF120918作为PET显像探针可以用来评价P-gp和BCRP的耐药功能。

P-糖蛋白；肿瘤；正电子发射断层显像术；乳腺癌耐药蛋白

肿瘤细胞多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）的产生是肿瘤化疗失败的主要原因，严重降低癌症患者的生存及生活质量。临床上MDR的产生一般由ATP结合盒式蛋白转运蛋白超家族引起，它是一种膜蛋白，通过ATP水解供能将化疗药物排出细胞，引发肿瘤的抗药性[1]。P-糖蛋白（P-gly-coprotein，P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）是ATP结合盒式蛋白转运蛋白超家族成员，这两种蛋白的过量表达参与肿瘤细胞对化疗的耐受[2]。目前，临床上对P-gp和BCRP的检测主要依赖于体外的定性、定量分析，无法在活体体内监测其表达与分布变化，这在一定程度上限制了肿瘤患者化疗前后MDR的动态检测[3]。P-gp抑制剂的PET显像剂目前正在被研究，此类显像剂将与P-gp结合而不被转运，在过表达的脑组织中表现出放射性增强，与放射性同位素标记的P-gp底物的结合恰恰相反，从而可以反映脑组织中P-gp水平[4－5]。本研究利用P-gp抑制剂11C-GF120918监测P-gp和BCRP在小鼠体内的表达与分布，评价其应用价值。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器

GF120918和11C-CH3I购自沈阳宝希迪商贸有限公司。异氟烷、吐温80、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）和羟基四丁胺购自Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司。应用日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，制备柱使用日本Capcell Pak公司的C18 UG 80色谱柱（10 mm×250 mm），分析柱使用美国Nova-Pak公司的C18柱（100 mm×8 mm）。其他仪器包括：自动伽玛粒子计数管（Wizard 3″1480，PerkinElmer，美国）、离心机（MX-105，托弥公司，日本）和PET仪（西门子公司，德国）。

正常小鼠55只，P-gp基因敲除鼠、BCRP基因敲除鼠和P-gp/BCRP基因敲除鼠各10只，均购自北京利昊生物科技有限公司，体重20～30 g，年龄2个月。

1．211C-GF120918合成

在0．35 ml溶有1．0 mg GF120918的DMF溶液中加入7 μl 0．33 mol/L羟基四丁胺的甲醇溶液，之后加入11C-CH3I，90℃反应5 min（图1），冷却后加入0．5 ml洗脱液，洗脱液成分为乙腈、水和三乙胺（60∶40∶0．1，V/V/V）。制备方法：洗脱液等度洗脱，洗脱流速4 ml/min，254 nm紫外检测器和辐射检测器检测，GF120918和11C-GF120918的保留时间分别为3．0～5．0 min和9．0～10 min；收集9．0～10 min组分，相同条件再次过柱纯化。生理盐水加吐温80（1 μl/ml）透析纯化产物，即得到可用于动物实验的11C-GF120918。

图1 11C-GF120918的合成 图中，DMF：二甲基甲酰胺。Fig.1 The synthesis of11C-GF120918

1．3 检测11C-GF120918在小鼠体内的分布

正常小鼠20只，通过静脉注射0．25 mg/kg11CGF120918，分别于5、15、30、60 min后断颈法处死小鼠，分析检测其在小鼠体内的组织分布情况。

正常小鼠每组5只，分为7组，分别注射0．25mg/kg11C-GF120918，同时每组分别注射0、0．1、0．5、1．0、3．0、5．0、10．0mg/kgGF120918，以未注射GF120918小鼠为对照组，30 min后断颈法处死，检测其在小鼠体内的组织分布情况。

通过检测小鼠的大脑、血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉在5、15、30 min和60 min时的放射性强度，获得11C-GF120918在小鼠体内的分布情况。使用自动伽玛粒子计数管测定放射性强度。放射性强度=[某组织放射性强度（MBq）/某单位组织样品（g）]/[注射剂量（MBq）/小鼠体重（g）]。

1．411C-GF120918在小鼠大脑和血液中的代谢

P-gp基因敲除组、BCRP基因敲除组、P-gp/ BCRP基因敲除组和野生型对照组小鼠，每组5只，分别注射0．015 mg/kg11C-GF120918，30 min后断颈法处死，解剖获得小鼠大脑，心脏取血。血液在4℃下经13 000×g离心3 min，取上层血清立即加入等体积的冰冷乙腈去蛋白，然后经20 000×g离心2 min，取上清。脑组织研碎溶于生理盐水中，加入等体积的乙腈，然后经20 000×g离心2 min，收集上清。

采用高效液相色谱法检测上清液中11CGF120918与11C代谢物含量，具体方法：洗脱液等度洗脱，洗脱液为乙腈与50 mmol/L醋酸钠盐缓冲溶液（pH 4．7，45∶55，V/V）混合液，11C-GF120918与11C代谢物的保留时间分别为6．2 min和2．2 min。检测11C-GF120918与11C代谢物，峰面积积分计算其含量。

1．5 小鼠11C-GF120918的PET显像

P-gp基因敲除组、BCRP基因敲除组、P-gp/ BCRP基因敲除组和野生型对照组小鼠，每组5只。使用异氟烷麻醉小鼠，静脉注射0．25 mg/kg11CGF120918，将小鼠背部朝上置于扫描床上，对小鼠脑部进行PET图像采集，采集时间为11C-GF120918注射后115～120 min。图像采集条件：以二维模式进行PET图像采集，采集完成后使用机器自动对PET图像进行衰减校正。图像重建采用有序子集最大期望值迭代法。用PETDyhamicsystem软件自动勾画出60 min放射性活性——时间动态曲线图，使用0～60 min脑曲线下面积[AUCbrain（0－60）min]表征总放射性强度。

1．6 数据处理

2 结果

2．111C-GF120918在小鼠体内的组织分布

不同时间小鼠不同组织器官的11C-GF120918放射性强度见表1。由表1可知，小鼠注射11CGF120918后，小鼠大脑摄取11C-GF120918剂量最少；小鼠血液中11C-GF120918的水平下降很快，15 min时11C-GF120918水平与5 min时相比，差异有统计学意义（χ2=7．56，P＜0．05）；心脏和肌肉中的摄取剂量呈降低趋势，30min时11C-GF120918水平与5 min时相比，差异有统计学意义（χ2=7．61和6．47，P＜0．05）；肝脏中11C-GF120918的摄取呈先升高后降低的趋势；脾脏对11C-GF120918的摄取在注射15 min后才开始缓慢上升，最后维持在一个相对稳定的水平，30 min时与5 min时的放射性强度比较，差异有统计学意义（χ2=7．79，P＜0．05）。

表1 不同时间时小鼠各组织器官的11C-GF120918放射性强度（±s）Table 1 The radioactivegy intensitu of11C-GF120918 in mouses at different time and different organs（±s）

表1 不同时间时小鼠各组织器官的11C-GF120918放射性强度（±s）Table 1 The radioactivegy intensitu of11C-GF120918 in mouses at different time and different organs（±s）

组织分布情况11C-GF120918放射性强度5 min 15 min 30 min 60 min大脑 0．06±0．01 0．05±0．01 0．05±0．00 0．04±0．00血液 0．28±0．03 0．17±0．01 0．15±0．02 0．12±0．01心脏 2．09±0．23 1．34±0．10 0．73±0．05 0．55±0．08肝脏 5．72±0．50 7．00±0．71 7．28±0．20 6．28±0．71脾脏 1．31±0．12 1．87±0．27 2．12±0．13 2．09±0．35肾脏 7．36±1．66 7．22±1．46 7．93±1．88 7．07±1．54肌肉 0．53±0．05 0．40±0．06 0．30±0．07 0．22±0．04

不同GF120918注射剂量下小鼠各组织器官的11C-GF120918放射性强度见表2。由表2可知，小鼠各组织器官对GF120918呈现不同的剂量依赖性，当注射剂量＞0．5 mg/kg，大脑对11C-GF120918的摄取显著升高，相对于对照组差异有统计学意义（χ2=8．56，P＜0．05）；血液中11CGF120918水平不受注射剂量的影响，维持稳定；心脏和肌肉中11C-GF120918的摄取都明显随注射剂量的增加而升高；肝脏和肾脏随注射剂量的增加而降低。

2．2 小鼠大脑和血液中11C-GF120918的代谢情况

野生型对照组小鼠体内注射11C-GF120918后30 min，大脑和血液中分别有（95．4±1．7）%和（95．8± 1．9）%的11C-GF120918未被代谢，而对于 P-gp/ BCRP基因敲除组小鼠大脑和血液中则分别有（99．3±0．5）%和（83．2±3．5）%未被代谢。在血液中，野生型对照组未代谢的11C-GF120918量高于BCRP基因敲除组和P-gp基因敲除组。

表2 不同GF120918注射剂量小鼠各组织器官的11C-GF120918放射性强度（±s）Table 2 The radioactiveity intensity of11C-GF120918 in mouse′s different organs with different GF120918 injected doses（±s）

表2 不同GF120918注射剂量小鼠各组织器官的11C-GF120918放射性强度（±s）Table 2 The radioactiveity intensity of11C-GF120918 in mouse′s different organs with different GF120918 injected doses（±s）

组织分布情况11C-GF120918放射性强度GF120918注射剂量（mg/kg）0．1 0．5 1．0 3．0 5．0 10．0大脑 0．05±0．01 0．06±0．01 0．20±0．02 0．30±0．03 0．53±0．04 0．67±0．14 0．73±0．08血液 0．17±0．01 0．17±0．02 0．21±0．01 0．17±0．02 0．17±0．01 0．17±0．01 0．18±0．01心脏 0．94±0．10 0．94±0．15 0．95±0．02 1．15±0．19 1．03±0．05 1．17±0．13 1．09±0．07肝脏 7．00±0．71 7．14±0．28 5．81±0．10 5．39±0．39 4．97±0．26 5．24±1．09 5．44±0．55脾脏 1．87±0．27 2．32±0．30 2．03±0．07 2．38±0．44 2．49±0．17 3．64±1．21 3．81±0．43肾脏 7．22±1．46 7．38±1．55 6．73±0．21 5．72±1．01 4．45±0．21 3．84±0．31 3．62±0．35肌肉 0．40±0．06 0．35±0．03 0．39±0．06 0．44±0．07 0．45±0．02 0．49±0．06 0．45±0．05对照组

2．3 小鼠的11C-GF120918 PET显像

小鼠注射11C-GF120918后行PET显像，结果发现，野生型对照组（图2中A）和BCRP基因敲除组（图2中C）小鼠大脑部的放射性强度相对较低，而P-gp基因敲除组（图2中B）与P-gp/BCRP基因敲除组（图2中D）的小鼠放射性强度相对较高。

图2 11C-GF120918在小鼠脑部的PET显像 图中，A：野生型对照组；B：P-gp基因敲除组；C：BCRP基因敲除组；D：P-gp/BCRP基因敲除组。Fig.2 The PET imaging of11C-GF120918 in mouse′s brain

同时，注射11C-GF120918后，P-gp/BCRP基因敲除组的摄取剂量先上升后平稳，而P-gp基因敲除组、BCRP基因敲除组和野生型对照组对11CGF120918的摄取是注射后立即下降然后平稳。对比平稳时的数据发现，P-gp/BCRP基因敲除组和P-gp基因敲除组的摄取分别是野生型对照组的9倍和3倍，差异具有统计学意义（χ2=7．69和8．24，P＜0．05）；BCRP基因敲除组与野生型对照组差异无统计学意义（图3）。

图3 不同时间小鼠大脑11C-GF120918放射性强度变化 图中，P-gp：P-糖蛋白；BCRP：乳腺癌耐药蛋白。Fig.3 The radioactivity intensity of11C-GF120918 in mouse′s brain at different time

对图3曲线进行积分计算总放射性强度，其中P-gp/BCRP基因敲除组60 min内[AUCbrain（0～60min）]总放射性强度为61．4±3．7、P-gp基因敲除组为16．8± 2．9、BCRP基因敲除组为5．9±0．5、野生型对照组为6．5±1．1。P-gp/BCRP基因敲除组与P-gp基因敲除组的总放射性强度分别为野生型对照组的9倍和3倍，差异有统计学意义（χ2=7．82和8．11，P＜0．05），BCRP基因敲除组和野生型对照组的总放射性强度无明显差异。

3 讨论

P-gp是ABC转运蛋白超家族成员之一，2009年Aller等[6]就发表了有关P-gp晶体结构的研究文章，目前临床上对P-gp的检测主要还是依赖病理组织在体外的定性、定量分析，无法在活体体内检测P-gp的表达与分布情况，这在一定程度上限制了肿瘤患者化疗前后MDR的动态检测。BCRP又称半转运蛋白，由一个C端的跨膜结构域和一个N端的核苷酸结构域组成。BCRP主要分布于脑、小肠和肝脏等正常组织和肿瘤细胞表面[7]，在肿瘤细胞中过表达，帮助肿瘤细胞外排药物，是一种干细胞检测标志物[8]。

本研究利用一种P-gp抑制剂11C-GF120918，研究P-gp和BCRP的药物外排功能，通过正电子核素标记来放大信号，产生类似PET显像探针的作用，并评价11C-GF120918探针在小鼠体内的组织分布以及代谢情况，为未来肿瘤患者MDR的改善以及化疗方法的优化提供重要的临床依据。

本研究在野生型小鼠体内注射11C-GF120918，30 min时大脑的摄取最少，并且很快达到平稳，11C-GF120918可以迅速从大脑中排出，这些结果表明该探针可被大脑的血脑屏障外排，且与11CLaniquidar注射后的情况一致。11C-Laniquidar是一种第三代MDR抑制剂，大脑摄取较低，所以在示踪剂中可以当作一种底物而不是抑制剂[9]。因此，本研究认为，11C-GF120918也可以被当作底物，并且注射后30 min是PET显像的合适时间。

当11C-GF120918注射剂量增加时，血液中的水平不会发生明显变化，因为其他组织会摄取血液中11C-GF120918，并且也会被肝脏、肾脏代谢，使血液中11C-GF120918的水平相对稳定，然而，这又同时导致大脑、心脏等组织中的11C-GF120918水平升高，即便存在血脑屏障的外排，但这种作用也是有限度的，另外，肝脏、肾脏可以代谢11CGF120918，所以注射剂量增加后，肝脏、肾脏中的11C-GF120918也不会明显升高。当11C-GF120918注射剂量>0.5 mg/kg时，其在大脑中的摄取也随之增加，并且P-gp/BCRP基因敲除组小鼠的总放射性强度是野生型对照组的9倍，这些结果表明11CGF120918在大脑中的渗透情况受P-gp和BCRP的调节，因此，体内11C-GF120918的放射性强度可以作为评价P-gp和BCRP功能的指标，并且，当注射剂量>3.0 mg/kg时可以应用于PET显像。

虽然11C-GF120918与BCRP的功能有关，但野生型对照组与BCRP基因敲除组的小鼠大脑中放射性强度不随时间改变，两组的总放射性强度也几乎是相同的。然而P-gp基因敲除组的总放射性强度是野生型对照组的3倍，却是P-gp/BCRP基因敲除组的1/4。这些结果可以解释为：因P-gp基因敲除组的BCRP mRNA水平是野生型对照组的3倍[10]，所以P-gp基因敲除组中BCRP会抑制11C-GF120918的渗透，因而P-gp基因敲除组的总放射性强度是P-gp/BCRP基因敲除组的1/4；P-gp和BCRP都是小鼠血脑屏障中重要的外流转运蛋白，从而保护大脑，P-gp基因敲除的小鼠会上调BCRP的表达[11]；野生组与BCRP基因敲除组结果相似，或许可以表明在限制11C-GF120918渗透的过程中，P-gp比BCRP起了更重要的作用。近期文献报道，在研究与P-gp和BCRP功能相关的大脑渗透探针时，P-gp/BCRP基因敲除组小鼠比P-gp或BCRP基因敲除组能更有效地放大与显示PET显像效果，从而应用于临床预警疾病[12]。

本研究中，野生型对照组中未代谢11CGF120918的量比P-gp/BCRP基因敲除组多12%，这表明11C-GF120918在肝肾中进行了新陈代谢并不是立即被P-gp或BCRP外排。也正是由于血脑屏障使得只有一小部分疏水的代谢物进入大脑，所以P-gp/BCRP基因敲除组的小鼠才会有一个相对较高的未代谢11C-GF120918量。

本研究创新之处在于使用PET显像探针11CGF120918用于P-gp和BCRP与大脑渗透作用相关功能的研究，结果表明，该探针具有相对较高的生化稳定性和放射性强度，可以较准确地反映P-gp和BCRP的水平和分布情况，并可用于PET体内显像评价P-gp功能，有助于指导肿瘤患者个体化用药，在未来临床研究和相关疾病的预防中有巨大潜力。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 何燕负责方法建立、论文撰写及其后期审阅工作；苏晋，郑晓霞 温莉，孙树兰负责现场实验、数据分析等工作。

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Developing P-glycoprote ininhibitor markedby PET

HeYan,SuJin,ZhengXiaoxia,WenLi,SunShulan
Department of Radiology,Binzhou City Center Hospital of Shandong Province,Binzhou 251700,China

He Yan,Email:495796192@qq.com

Objective To explore a PET probe,11C-GF120918 in the assessing of the function and significance of P-glycoprotein（P-gp）and breast cancer resistance protein（BCRP）．MethodsThe mice were injected with chemically synthesized11C-GF120918．An automatic gamma counter was used to measure the11C-GF120918 radiation intensity of the various organs of the mice at different times and dosages．Simultaneously,HPLC was employed to detect the metabolism of11C-GF120918 in the brain and blood of the mice．The four mice groups,namely,P-gp knockdown mice,BCRP knockdown mice,P-gp/ BCRP knockdown mice,and wild mice,were manually injected with11C-GF120918．The radiation intensity of11C-GF120918 in the mice brain was detected by PET．ResultsAfter the11C-GF120918 injection,the tissues and organs of mice were more widely distributed compared with those of the wild mice（χ2=8．14,P＜0．05）．Thirty minutes after injection,the11C-GF120918 radiation intensity in the brain and blood were still（99．3±0．5）%and（83．2±3．5）%,respectively,with better biochemistry and radiation stability．In PET studies,AUCbrain[0～60min]in the P-gp knockout mice was nine times higher than that in the wild group（χ2=7．69, P＜0．05）．The AUCbrain[0－60min]of the BCPR knockout mice was three times higher than that in the wild group（χ2=8．24,P＜0．05）．The evident effect of11C-GF120918 was relatively stable．Conclusion11CGF120918 can be used as PET probes to evaluate the multi-drug resistance of P-gp and BCRP．

P-glycoprotein;Neoplasms;Positron-emission tomography;Breast cancer resistance protein

何燕，Email：495796192＠qq．com

10．3760/cma．j．issn．1673－4114．2016．01．001

2015-04-05）