基于“异类相制”的雷公藤复方配伍减毒代谢组学研究お

谢彤 周学平 林丽丽 徐建亚 沈存思 冯哲 周玲玲 单进军

[摘要]采用基于气相色谱质谱联用技术（GCMS/MS）的代谢组学方法，分析雷公藤复方配伍前后对大鼠血浆中内源性代谢物的变化，以期阐明基于“异类相制”中医理论的清络通痹方对雷公藤的配伍减毒机制。通过GCMS/MS分析获得空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组大鼠血浆代谢轮廓，正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）显示3组在得分图上区分明显， 清络通痹方组各观测值存在着向正常组移动的趋势，提示了清络通痹方的配伍减毒功效。通过变量重要性投影（VIP）值和单因素方差分析筛选差异性代谢物，发现雷公藤组中生糖氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸等水平显著升高，支链氨基酸缬氨酸和异亮氨基酸水平下降，清络通痹方则能够逆转氨基酸水平的紊乱。进一步的代谢通路分析提示清络通痹方配伍减毒机制可能与谷氨酸和谷氨酰胺代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关。该研究从代谢的角度，说明了雷公藤肝脏毒性的发生与氨基酸代谢，能量代谢等过程密切相关，而清络通痹方通过改善机体氨基酸水平发挥配伍减毒作用。

[关键词]异类相制；雷公藤；代谢组学；肝毒性；清络通痹方

雷公藤作为中国传统医学中的一种常用中药，具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结的功效，临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎等疾病。尽管雷公藤治疗免疫系统疾病疗效确切，却存在明显的肝毒性[12]。雷公藤的临床治疗窗较窄，对机体毒性损伤严重，是目前亟需解决的问题。在国医大师周仲瑛的指导下，南京中医药大学周学平教授以临床实践为基础，提出 “异类相制”的学术指导，即通过具有不同功效的中药配伍来制约雷公藤毒烈偏颇之性的效用[34]。在此基础上，周学平教授用青风藤15 g，生地15 g，三七10 g，僵蚕3 g与雷公藤5～15 g相配伍，组成“清络通痹方”。该方在临床上能够明显的降低雷公藤产生的肝毒性。该方中，三七散瘀止血、消肿定痛，生地清热生津、滋阴养血，与雷公藤配伍能达到异效相制、扶正制毒的功效。周聪等通过加减配伍药对的方法证实，在清络通痹方中，生地和三七对正方配伍减毒的功效贡献度最大[5]。尽管清络通痹方配伍减毒的疗效确切，然而目前都是从单一的信号分子通路去研究，缺乏整体的评价体系和研究方法。

代谢组学的发展给中医药毒性评价和毒性机制研究带来新的机遇和挑战[67]。运用代谢组学技术能够从整体角度评价生物体产生的毒性变化，预测毒性产生，寻找毒性相关生物标志物，从而阐明毒性机制。Xiong等建立了GCMS的代谢组学方法全面表征对乙酰氨基酚诱导的肝毒性[8]；Gonzalez等建立的基于液相的代谢组学方法评价急性肝损伤可能发生的机制[9]。因此，本文在前期实验的基础上，运用代谢组学技术手段来阐述清络通痹方配伍减毒的可能机制，为“异类相制”中医理论的科学内涵提供技术支撑，为其他毒性中药以及毒性中药配伍理论的探讨提供新的研究思路。

1材料

低温高速离心机（Beckman，美国）；真空旋转挥干仪（Speedvac，Thermo Savant，美国）；气相色谱三重四级杆质谱联用仪（GCMS/MS，Thermo，美国）；气相毛细管柱为熔融的硅烷化石英毛细管（DB5固定相，018 mm×10 m，018 μm，Thermo，美国）。

1，213C2肉蔻酸（同位素内标）、盐酸甲氧胺、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、N甲基N三甲基硅烷三氟乙酰胺（MSTFA）均购自SigmaAldrich，MSTFA含1%TMCS；甲醇和正庚烷（色谱纯）均购自Merck公司（德国）；超纯水（自制，Millipore，美国）；各鉴定用对照品、乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）等其他试剂均为分析纯。

雷公藤药材产自四川西昌，批号120620；三七、地黄、僵蚕、青风藤药材均购自安徽亳州中药饮片厂，批号111208。经南京中医药大学药学院中药鉴定教研室刘圣金博士鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部中相关规定。

雌性SD大鼠30只，体重（200±20） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）20120001。

2方法

21动物实验实验开始前，30只雌性SD大鼠在屏障环境中适应7 d，自由摄取食和水。实验开始时，将大鼠随机分成3组，空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组，每组10只。每天早晨灌胃给药10 mL·kg-1，连续28 d。实验结束，取大鼠血浆于离心管中，置于-20 ℃冰箱保存备用。

22药材提取临床上雷公藤常用剂量为008～025 g·kg-1·d-1，前期试验发现，10倍临床剂量的雷公藤能够诱导产生稳定、明显的肝毒性（即08～25 g·kg-1·d-1），推算至相应的大鼠剂量为5～15 g·kg-1·d-1，因此本实验选用雷公藤剂量为15 g·kg-1·d-1（即临床最大剂量的10倍）。复方中其他配伍中药仍然按照临床剂量进行给药。

雷公藤提取：称取雷公藤1 500 g，加水12 L，水煎煮提取2次，每次2 h，放冷，合并2次滤液，滤过。滤液置于真空旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器和残渣，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，摇匀。得到雷公藤生药的质量浓度为15 g·mL-1，置于4 ℃冰箱，备用。

清络通痹方提取：称取雷公藤1 500 g、生地150 g、僵蚕30 g、青风藤150 g、三七100 g，混合，加水12 L，水煎提取2次，每次2 h，放冷，合并2次滤液，滤过。滤液置于真空旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器和残渣，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到清络通痹方（方中雷公藤生药的质量浓度为15 g·mL-1）。置于4 ℃冰箱，备用。

23血浆样品处理取大鼠血浆50 μL于15 mL离心管中，加入150 μL甲醇（含内标1，213C肉蔻酸25 mg·L-1），涡旋5 min后17 000 r·min-1离心10 min，取上清100 μL置于离心浓缩仪中挥干。向上述样品中加入30 μL甲氧胺吡啶溶液（10 g·L-1），涡旋1 min后震荡15 h。加入30 μL BSTFA（含体积分数为1%TMCS）溶液后，取上清用于GCMS/MS进样分析。

24气相色谱质谱条件载气为氦气，流速12 mL·min-1，分流比为20∶1，进样口温度为250 ℃，传输线温度为250 ℃。EI离子源，温度为280 ℃。电离能为70 eV，质谱采用一级全扫描的采集方式，m/z采集范围50～500，采集时间35～19 min。程序升温：起始温度60 ℃，保持1 min后，以20 ℃·min-1速度升至320 ℃后，保持5 min。进样量为1 μL。

25数据处理将各色谱峰的EI碎裂图谱与NIST标准谱库进行比对，对内源性成分进行结构确定。利用Xcalibur 21软件（Thermo，美国）对色谱峰的保留时间进行相对定量。多元数据分析和建模均采用SIMCAP 120软件（Umetrics， Sweden）完成。采用偏最小二乘判别分析（OPLSDA）来区分各组的样本。最终用Splot以及VIP值来筛选差异性的代谢产物，并通过单因素方差分析最终确定差异内源性成分。

3结果与讨论

31雷公藤肝毒性以及清络通痹方配伍减毒生化结果生化检测结果表明，雷公藤提取物能够显著引起血浆中谷丙转氨酶（ALT）以及谷草转氨酶（AST）的升高，而清络通痹方则能够逆转转氨酶的升高，提示该剂量下的雷公藤能够诱发产生肝毒性，而清络通痹方则能够产生配伍减毒的作用，见图1。

32血浆中内源性小分子化合物的测定在实验过程中优化了进样量以及分流比，发现在分流的情况下，以20∶1的分流比进样，各色谱峰之间分离度较好，峰形佳。经过GCMS/MS分析得到血清总离子流图，见图2A。所得每个质谱碎裂图与NIST标准谱库比对，共鉴定出72个化合物，其中包含了大量的内源性代谢产物，例如氨基酸、糖类、脂肪酸以及三羧酸循环中间产物等。

33雷公藤及清络通痹方对机体代谢的影响将空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组进行OPLSDA分析，得到2个主成分的模型分析（R2X：868%，Q2：647%），二维得分图见图2B。从图中可以看到，雷公藤组、清络通痹方组与空白对照组区分较为明显，提示相比空白对照组，雷公藤组改变了正常大鼠血浆中内源性代谢物的水平，验证了雷公藤具有明显的肝脏毒性；以主成分1为参照，清络通痹方组大鼠血浆中内源性代谢物具有向空白对照组移动的趋势，说明复方配伍能够逆转雷公藤诱导产生的肝毒性。

34差异化合物的筛选分别比较了空白对照组和雷公藤组，以及雷公藤组和清络通痹方组，绘制Splot图，以VIP值大于10为标准寻找差异化合物，见图3。结果发现，空白对照组和雷公藤组相比，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺对模型的贡献比较大；雷公藤组与清络通痹方组比较，草酸、乳酸、葡萄糖、尿素、半乳糖醛酸、丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和脯氨酸对模型的贡献度较大。

35代谢通路分析肝脏是氨基酸代谢的中心器官，肝脏发生损伤后，常发生氨基酸代谢的紊乱。使用Metabo Analyst 30 软件（http：//www. metaboanalyst. ca/）进行了代谢通路分析。结果发现，在整个模型中谷氨酸和谷氨酰胺代谢通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢影响较大，见图4。谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸以及脯氨酸是机体的生糖氨基酸。雷公藤诱导产生肝毒性，蛋白质产生分解，使得部分的生糖氨基酸游离至血浆。清络通痹方能够逆转氨基酸水平的升高，提示了配伍减毒的功效。相反，支链氨基酸缬氨酸和异亮氨基酸水平显著降低[10]。慢性肝毒性的发生往往伴随支链氨基酸合成异常，支链氨基酸作为肝毒性的指标之一，提示肝毒性的产生，而清络通痹方并没有能够逆转支链氨基酸的降低，说明清络通痹方中其他成分可能会导致氨基酸的降低。

氨基酸代谢异常也影响机体的尿素水平。雷公藤导致机体蛋白降解，氨基酸水平升高，使得氨基酸脱氨基代谢增加，从而表现出尿素水平的升高。清络通痹方配伍后，尿素水平显著降低。

文献报道雷公藤中的主要成分雷公藤甲素抑制线粒体功能从而产生肝毒性。本实验中发现，雷公藤诱导使得机体的葡萄糖水平显著上升，说明线粒体利用葡萄糖氧化产能受阻，表明雷公藤影响了能量代谢。3羟基丁酸是一种酮体，雷公藤抑制线粒体能量代谢，使得糖异生代谢途径增加，酮体作为一种能量源，进入糖异生代谢通路，产能供机体使用，最终使得3羟基丁酸的含量降低，见图5。

4讨论

中医在“七情”以及“君臣佐使”的理论基础上合理配伍中药，采用复方治疗各种疾病。本实验采用代谢组学技术手段，从整体微观角度描述了雷公藤复方配伍前后大鼠血浆代谢轮廓的变化。研究结果表明，空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组大鼠血浆中内源性成分在OPLSDA得分图中区分明显，清络通痹方能够使代谢轨迹从雷公藤肝毒性向正常组转移，提示清络通痹方配伍减毒的作用。代谢通路结果提示，雷公藤主要影响了机体的氨基酸代谢以及能量代谢，而清络通痹方则通过逆转氨基酸代谢的紊乱发挥配伍减毒的作用。清络通痹方基于中医理论“异类相制”而提出。配伍方中，三七养血、止血、化瘀。现代药理学研究表明，三七能够改善肝脏微循环，促进肝脏蛋白质合成，从而达到保肝的作用，在方中发挥“异效制毒”的功效。这与本文中清络通痹方通过纠正机体氨基酸水平的紊乱发挥配伍减毒的作用机制相符合，提示方中三七可能通过改善氨基酸代谢发挥“异效制毒”的机制。配伍方中，生地滋阴生津、止血抗凝。现代药理学发现，生地改善机体的糖代谢。本文研究发现，雷公藤诱导使得机体能量代谢异常，葡萄糖、乳酸和羟基丁酸水平下降，而给予清络通痹方后，乳酸水平表现升高趋势，提示清络通痹方可能改善了能量代谢，机体通过其他途径如糖异生等代谢产能。这与方中生地的功效相符合，表明方中生地通过改善机体糖代谢发挥“扶正制毒”的功效。本实验通过代谢组学技术和分析，从代谢的角度初步阐明雷公藤的肝毒性机制，进而探讨其复方（清络通痹方）配伍减毒机制，从整体微观的角度阐明了中医遣方用药以及中医理论的科学内涵，为其他毒性中药的研究提供示范性思路。

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[责任编辑曹阳阳]