原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA表达及意义

王建新

(南阳医学高等专科学校第一附属医院，河南南阳473058)

原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA表达及意义

王建新

(南阳医学高等专科学校第一附属医院，河南南阳473058)

目的 探讨原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA表达及其与患者临床病理参数、预后的关系。方法 选择原发性胆囊癌患者20例(胆囊癌组)，其中有转移者11例、无转移者9例，慢性胆囊炎患者17例(对照组)。取两组胆囊组织标本，采用RT-PCR技术检测胆囊组织中nm23-H1B mRNA的相对表达量，并分析其表达与原发性胆囊癌患者临床病理参数及预后的关系。结果 胆囊癌组及对照组nm23-H1B mRNA的相对表达量分别为12.943±3.241、19.343±2.044；胆囊癌组有转移及无转移者分别为10.592±1.522、15.817±2.271；胆囊癌组nm23-H1B mRNA的相对表达量低于对照组，且胆囊癌组有转移者明显低于无转移者及对照组(P均<0.01)。原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA低表达与肿瘤肝脏浸润、肝脏转移、淋巴结转移、胰腺转移、腹膜转移及Nevin分级有关(P均<0.05)。Kaplan Meier生存分析显示，nm23-H1B mRNA低表达者术后3年生存率明显低于nm23-H1B mRNA高表达者(P<0.01)。结论 原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA表达降低，其表达变化与肿瘤转移程度及患者预后有关。

原发性胆囊癌；nm23-H1B；生存时间

原发性胆囊癌是临床常见的胆道系统肿瘤，恶性程度较高，患者预后一般较差[1，2]。因其临床早期诊断较困难，故寻找早期特异性的诊断指标可能有助于该病的早期诊断。nm23基因是最早被发现的抑制肿瘤转移基因之一，其家族包括8个成员，其中nm23-H1和nm23-H2被证实具有抑制肿瘤转移的能力,目前研究较多的是nm23-H1[3]。nm23-H1B是nm23-H1基因的不同剪切形式，其编码蛋白在原发性胆囊癌中的作用鲜见报道。2005年3月～2010年6月，我们观察了原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA的表达，并探讨其表达与患者临床病理参数及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期我院收治的原发性胆囊癌患者20例(胆囊癌组)，男12例、女8例，年龄41～62岁、平均52.1岁；Nevin分期：Ⅰ～Ⅲ期9例，Ⅳ、Ⅴ期11例；组织分化程度：低中分化12例，高分化8例；肝脏浸润8例，胆管受侵6例，淋巴结转移11例，胰腺转移9例，腹膜转移10例，并依据有无淋巴结或远处转移分为有转移者(Ⅳ、Ⅴ期)11例、无转移者(Ⅰ～Ⅲ期)9例。同期另选慢性胆囊炎患者17例(对照组)，男10例、女7例，年龄40～59岁、平均49.2岁。两组均经组织病理检查明确诊断。排除合并重要脏器严重器质性病变者，临床资料不完整者，无法进行随访者，随访过程中因其他疾病死亡者。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 nm23-H1B mRNA表达检测 取两组胆囊组织标本立即置入液氮中，-80 ℃冰箱冻存备用。TRIzol法提取组织中总RNA，分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，应用oligo(dT)引物和M-MLV逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA。获得的cDNA产物采用SYBR GreenⅡ染料染色后进行RT-PCR检测。引物序列：nm23-H1B上游引物：5′-CGGAGTTCAAACCTAAGCAG-3′，下游引物：5′-GATCGCAATGAAGGTACGCTCACAG-3′；内参β-actin上游引物：5′-ACACTGTGCCCATCTACTAGG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3′。所有引物热循环条件相同，反应体系均为20 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。基于内参β-actin mRNA表达建立标准曲线，采用经典的ΔCt法对nm23-H1B mRNA的表达进行定量，同时根据β-actin mRNA表达进行归一。归一后平均值在2以上的数值作为nm23-H1B mRNA的相对表达量。

1.3 随访 采用电话随访的方式，随访截至2013年8月，随访时间1～36个月、中位随访时间21个月，失访2例。终止事件为患者死亡。采用Kaplan Meier生存分析法计算患者生存率，Long-rank检验进行比较。

2 结果

2.1 两组nm23-H1B mRNA表达比较 胆囊癌组及对照组nm23-H1B mRNA的相对表达量分别为12.943±3.241、19.343±2.044；胆囊癌组有转移者及无转移者分别为10.592±1.522、15.817±2.271；胆囊癌组nm23-H1B mRNA的相对表达量低于对照组，且胆囊癌组有转移者明显低于无转移者及对照组(P均<0.01)。

2.2 nm23-H1B mRNA表达与患者临床病理参数的关系 以受试者工作特征曲线中约登指数最高值(12.64)作为nm23-H1B mRNA表达水平的分割点，>12.64为nm23-H1B mRNA高表达，≤12.64为nm23-HIB mRNA低表达，分析nm23-HIB mRNA低表达与患者临床病理参数的关系。结果见表1。

表1 原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA低表达与患者临床病理参数的关系

2.3 nm23-H1B mRNA表达与患者预后的关系 nm23-H1B mRNA低表达者与高表达者术后3年生存率分别为0、77.9%，二者比较差异有统计学意义(χ2=6.853，P<0.01)。见图1。

3 讨论

nm23基因是目前公认的具有抑制肿瘤转移作用的基因[4]。nm23-H1编码的nm23-H1蛋白具有二磷酸核苷酸激酶活性，能够催化转移磷酸基团从NTP到NDP，以此维持核苷酸平衡，影响细胞骨架形态、参与细胞分裂时纺锤体的形成和GTP介导的信号传导途径、微管组装等，从而影响细胞的增殖、分化，达到抑制肿瘤转移的目的[4～7]。有研究发现，nm23-H1蛋白低表达与乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多种恶性肿瘤的高转移潜能显著相关[8～12]。因此，nm23-H1基因被认为是对肿瘤转移起负调节作用的肿瘤抑制基因。有研究表明，nm23-H1表达与胆囊癌转移呈负相关，是患者预后的独立影响因素[13,14]，说明nm23-H1在胆囊癌转移中发挥独立的生物学调节作用。

图1 原发性胆囊癌不同nm23-H1B mRNA表达者的生存曲线

nm23-H1定位于染色体17q21.33，cDNA克隆的序列全长987 bp，编码一个有177个氨基酸的蛋白质，有nm23-H1B和nm23-H1A两个亚基，是nm23-H1基因的不同剪切形式。nm23-H1B基因在结构上比nm23-H1A多了1个220 bp的外显子，编码的蛋白质延伸了25个氨基酸残基，在这25个氨基酸残基中有1个酪蛋白激酶(CK)磷酸化位点结构域[7]。CK是一种嗜酸性蛋白底物(如酪蛋白)，存在于多种组织和细胞膜室的蛋白激酶。因此推测，nm23-H1B基因可能通过调节CK的功能，参与肿瘤细胞转录调控、增殖、信号传导，与肿瘤的发生、发展有关[15]。

本研究结果显示，胆囊癌组有转移者nm23-H1B mRNA的相对表达量明显低于无转移者及对照组，且无转移者低于对照组；本研究还发现，原发性胆囊癌组织nm23-H1B mRNA低表达与肿瘤肝脏浸润、肝脏转移、淋巴结转移、胰腺转移、腹膜转移及Nevin分期有关；生存分析显示，nm23-H1B mRNA低表达者术后3年生存率明显低于高表达者，nm23-H1B mRNA低表达与患者预后存在显著相关性，说明nm23-H1B是原发性胆囊癌患者预后不良的危险因素。提示nm23-H1B基因高表达可能对原发性胆囊癌的发展有抑制作用。

综上所述，原发性胆囊癌组织中nm23-H1B mRNA表达降低，其低表达与肿瘤转移程度及患者预后有关。nm23-H1B mRNA低表达可作为预测原发性胆囊癌恶性程度及预后判断的参考指标之一。

但本研究只局限于临床标本检测，对其抑制肿瘤转移的机制尚不清楚，仍需进一步深入研究。

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河南省医学科技攻关计划项目(201403213)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.014

R735.8

B

1002-266X(2016)24-0042-03

2015-10-11)