酒精性肝病大鼠肝组织PPARα表达及意义

曹智丽，周俊英，王娟，王艳，王维，张文双

(1河北北方学院附属第二医院，河北张家口075100；2河北医科大学第三医院)

酒精性肝病大鼠肝组织PPARα表达及意义

曹智丽1，周俊英2，王娟1，王艳1，王维1，张文双1

(1河北北方学院附属第二医院，河北张家口075100；2河北医科大学第三医院)

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)在酒精性肝病发生、发展中的作用。方法 选择Wistar大鼠50只，随机取40只采用乙醇灌胃法制备酒精性肝病模型，根据造模时间不同分为模型4、8、12、16周组。至造模结束，共成模35只，模型4、8、12、16周组分别10、9、8、8只；剩余10只作为正常对照组，不予任何处理。各组处死后留取肝组织标本。采用免疫组化染色法、Western blotting法、RT-qPCR法检测PPARα蛋白及mRNA表达。结果 免疫组化染色显示，PPARα蛋白定位于肝细胞胞质，呈棕黄色染色。正常对照组肝细胞PPARα蛋白表达丰富；随着造模时间的延长，各模型组肝组织PPARα蛋白表达逐渐减少，模型16周组肝组织仅见少量PPARα蛋白表达。Western blotting、qRT-PCR检测结果显示，各模型组PPARα蛋白及mRNA表达均低于正常对照组(P均<0.05)；随着造模时间的延长，PPARα蛋白及mRNA表达逐渐降低(P均<0.05)。结论 PPARα可能参与酒精性肝病的发生、发展。

酒精性肝病；过氧化物酶体增殖物激活受体α；大鼠

近年来，酒精性肝病的发病率逐年升高，已成为继病毒性肝炎后导致肝损伤的第二大病因。酒精性肝病的病理变化最初主要为肝细胞脂肪变性，随后进展为脂肪性肝炎、肝纤维化，最终导致肝硬化。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核激素受体家族中的配体激活受体，分为α、β、γ三种亚型，其中PPARα可通过多种途径参与脂质代谢的调节。但其在酒精性肝病发病过程中作用的研究鲜见报道。2013年12月～2014年12月，我们观察了酒精性肝病大鼠肝组织PPARα表达，现分析结果并探讨其在酒精性肝病发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，清洁级，3月龄，体质量(200±20)g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。饲养环境：温度(22±2)℃，湿度(70±5)%。主要仪器：UV-2550PCX型紫外分光光度计，宁波新芝生物科技股份有限公司；ABI7500型实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司；电泳仪，美国Hoefer公司；5417R型台式高速冷冻离心机，德国EP公司。主要试剂：TRIzol试剂，北京康为世纪生物科技有限公司；PCR逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、PPARα上下游引物、β-actin上下游引物，美国Invitrogen公司；PPARα抗体，美国Epitomics公司；β-actin抗体，杭州华安生物有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，美国KPL公司；ECL发光液，美国Santa Cruz公司；RIPA细胞裂解液，北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜，美国Millpore公司。

1.2 模型制备及干预 所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只采用乙醇灌胃法[1]建立酒精性肝病模型。根据造模时间不同分为模型4、8、12、16周组，每组10只。1～4周给予30%乙醇5.0 g/(kg·d)灌胃，5～8周给予40%乙醇6.0 g/(kg·d)灌胃，9～12周给予50%乙醇7.0 g/(kg·d)灌胃，13～16周给予60%乙醇8.0 g/(kg·d)灌胃。每日9：00灌胃，1次/d。模型制备过程中5只大鼠因乙醇误吸入气管窒息死亡，模型4、8、12、16周组分别有10、9、8、8只成模。各组造模结束禁食12 h处死，留取肝组织标本。剩余10只作为正常对照组，不予任何处理，直接处死留取肝组织标本。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肝组织PPARα蛋白表达 ①采用免疫组化法。取各组肝组织，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规方法制备组织切片，免疫组化染色，显微镜下观察。②采用Western blotting法。取100 mg肝组织制备组织匀浆；提取蛋白并定量后，行SDS-PAGE电泳，蛋白转移至PVDF膜；将PPARα、β-actin一抗加入不同标记的PVDF膜上，洗膜、定影，最后ECL显影。应用Image J软件测定条带灰度值，以目标条带与内参条带灰度的比值作为PPARα蛋白的相对表达量。

1.3.2 肝组织PPARα mRNA表达 采用RT-qPCR法。取部分肝组织以TRIzol法提取RNA，逆转录为cDNA，应用荧光定量PCR试剂盒、ABI7500型实时荧光定量PCR仪测定PPARα mRNA表达。引物由美国Invitrogen公司合成，PPARα：上游引物5′-CACGATGCTGTCCTCCTT-3′，下游引物5′-TCCAGTTCGAGGGCATTG-3′；β-actin：上游引物5′-CCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物5′-CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算PPARα mRNA的相对表达量。

2 结果

免疫组化染色显示，PPARα蛋白定位于肝细胞胞质，呈棕黄色染色。正常对照组肝细胞PPARα蛋白表达丰富(插页Ⅱ图5A)；随着造模时间延长，各模型组肝组织PPARα蛋白表达逐渐减少(插页Ⅱ图5B、5C、5D)，至模型16周组时肝组织仅见少量PPARα蛋白表达(插页Ⅱ图5E)。

正常对照组肝组织PPARα蛋白及mRNA相对表达量均高于各模型组(P均<0.05)。随着造模时间的延长，各模型组肝组织PPARα蛋白及mRNA相对表达量逐渐降低(P均<0.05)。各组肝组织PPARα蛋白及mRNA相对表达量比较见表1。

表1 各组肝组织PPARα蛋白及mRNA相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型4周组比较，#P<0.05；与模型8周组比较，△P<0.05；与模型12周组比较，▲P<0.05。

3 讨论

酒精性肝病是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，随着病程进展，可逐渐发展为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化等[2]。酒精性肝病早期典型的病理变化是肝细胞脂肪变性，一旦去除乙醇诱因，脂肪变性往往能够恢复正常。若脂肪合成、分解、代谢等出现异常，代谢紊乱会加重肝细胞损伤，且肝细胞损伤与肝脏脂肪沉积的程度密切相关。在乙醇引起肝细胞脂肪沉积的基础上肝细胞受到氧化应激作用，炎症反应加重，可进一步加重肝脏的病理损伤[3，4]。

PPARα是一种参与调节脂肪酸氧化和运输的核激素受体，其参与脂质代谢的各个环节，包括脂肪酸在细胞内结合、脂肪酸透膜吸收、脂蛋白合成与转运等，其表达与肝脏乙醇代谢和脂质代谢密切相关[5]。有研究证实，乙醇通过抑制PPARα的表达及破坏PPARα蛋白的功能，干预脂肪酸的氧化及转运途径，抑制甘油三酯合成，最终引起脂质代谢障碍[6]；而脂质代谢失衡可导致肝内脂质聚集过多，超过肝负荷，即引起肝细胞脂肪变性，肝组织内过量脂质浸润可引起线粒体损伤、氧化应激及炎症反应，进一步加重肝损伤[7]。Lebrun等[8]研究发现，随着酒精性肝病造模时间延长，肝组织脂肪沉积逐渐增多，至造模结束时肝细胞内已呈弥漫小泡性脂肪变性。Nakajima等[9]研究发现，乙醇长期喂养可降低小鼠肝组织PPARα mRNA和蛋白的表达，下调PPARα的靶基因表达，如酰基辅酶α氧化酶、中链酰基辅酶α脱氢酶、脂肪酸结合蛋白等；有研究还发现，应用乙醇诱导PPARα基因敲除的小鼠比野生型小鼠更易发生肝损伤，说明PPARα表达可被乙醇抑制，从而导致脂肪酸β氧化减少，促进脂肪酸和甘油三酯的合成，进一步导致肝细胞脂肪变性的发生[10～14]。Sahebkar等[15]研究也证实，随着乙醇代谢产物乙醛生成量的增多，PPARα表达逐渐减少，肝细胞所受伤害和毒性作用相继出现，如线粒体损伤、炎性损伤等。

本研究各模型组PPARα蛋白及mRNA表达均低于正常对照组；随着造模时间延长，各模型组肝组织PPARα蛋白及mRNA表达逐渐降低。推测激活PPARα受体可促进脂肪酸氧化基因、脂质合成基因的表达，从而改善乙醇引起的脂质代谢紊乱，减轻肝细胞脂肪累积[16～19]。

综上所述，我们认为PPARα可能参与酒精性肝病的发生、发展，其具体作用机制尚不清楚，仍需进一步研究。

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张家口市科技计划自筹经费项目(1521060D)。

周俊英(E-mail： doctorzhoujy@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.010

R575.5

A

1002-266X(2016)24-0031-03

2016-01-12)