优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响

万学瑞，吴建平，雷赵民*，何轶群，吴润

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)



优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响

万学瑞1，吴建平2，雷赵民2*，何轶群1，吴润1

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

摘要：为了探讨乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量及其pH的影响，进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的乳酸菌接种剂，将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮，分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量的动态变化及pH。结果显示，在青贮过程和有氧暴露后，分别添加肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2和发酵乳杆菌E2-3的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组，而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组，pH亦低于对照组。其中B1-7和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多，从青贮第7天开始到有氧暴露的30 d内，始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低。以上结果表明这5株乳酸菌具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力，其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。

关键词：全株玉米；青贮；植物乳杆菌B3-1；pH

青贮过程是一个复杂的微生物发酵体系，有乳酸菌、腐败细菌、酵母菌、霉菌、芽孢杆菌等多种微生物参与，其中乳酸菌被认为是决定青贮发酵能否成功的关键微生物。青贮饲料品质的好坏与它所含乳酸菌的类型、数量和活性有很大的关系，但秸秆类植物表面附生的乳酸菌数量往往较少，为调制高品质的青贮饲料，最可行有效的方法是添加优质乳酸菌，增加青贮饲料原料中初始乳酸菌数量，使之尽快尽早进入乳酸发酵阶段，乳酸浓度增加，pH迅速下降，抑制有害菌的生长，改善青贮饲料发酵品质，青贮料才能长期保存完好[1-2]。如全株玉米(Zeamays)中添加乳酸菌制剂使青贮饲料发酵过程中的有益微生物数量急剧增加，抑制了酪酸菌及其他不良菌的繁殖，明显改善了青贮饲料的发酵品质[3]。在意大利黑麦草(Loliumperenne)中添加乳酸菌能有效地抑制霉菌、酵母菌和细菌的繁殖，提高乳酸的含量，降低青贮饲料的pH值，改善青贮饲料的发酵品质[4]。异型发酵乳酸菌虽然累积乳酸的能力不如同型发酵乳酸菌，但其除了能产生乳酸，还能产生挥发性短链脂肪酸如乙酸等，能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的生长，可抑制青贮饲料的二次发酵，提高有氧稳定性，减少青贮饲料在饲喂过程中的营养损耗[5-8]。目前，已报道能提高青贮饲料有氧稳定性的乳酸菌主要是布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)，如全株玉米中添加布氏乳杆菌进行青贮，可降低青贮饲料的乳酸浓度，提高乙酸浓度，降低酵母菌数量，提高青贮饲料的有氧稳定性[9]。因此，筛选更多的能抑制青贮饲料二次发酵，提高有氧稳定性的青贮用乳酸菌势在必行。

作为青贮添加剂的优良乳酸菌必须具有较强的附着能力和生长能力[10]，而从青贮原料或青贮饲料中分离筛选乳酸菌最容易满足以上要求。虽然关于玉米青贮的乳酸菌已有较多报道[11-12]，但还没有适合甘肃地区全株玉米青贮的乳酸菌接种剂，本实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离获得32株乳酸菌，利用产酸试验和抑菌试验筛选青贮用优良乳酸菌，其中植物乳杆菌B3-1培养6 h时pH即达到3.3，8 h达到3.0，产酸较快、较多，且其培养上清液对供试的金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌和酵母菌均具有较强的抑菌活性，但对青霉、曲霉和根霉菌没抑菌活性。肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、屎肠球菌B5-2、发酵乳杆菌E2-3分别在分离的同类型乳酸菌中产酸和抑菌特性均最优[13]。以上5株乳酸菌均显示出优良的青贮潜能，为验证其青贮效果，本研究以这5株乳酸菌作为接种剂，实验室内青贮全株玉米。通常，评价乳酸菌接种剂对青贮饲料品质及有氧稳定性的影响效果是通过检测发酵产物，然而，青贮饲料中微生物菌群的变化是导致发酵产物改变的主要原因，因此，本论文通过跟踪分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中微生物数量的动态变化及pH，初步判断接种乳酸菌的青贮潜能，为筛选出更加适合甘肃地区全株玉米青贮发酵的优良乳酸菌提供依据。

1材料与方法

1.1菌种

供试乳酸菌包括：肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroidessubsp.Mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceu)B2-3、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)B3-1、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)E2-3均由本实验室分离鉴定并保存。

1.2青贮饲料的调制

2012年9月16日，自甘肃农业大学动物科学技术学院产学研基地(甘肃省临洮县)采集青贮用全株玉米，经切割机切成2～4 cm，混匀即为青贮原料，用微波炉进行快速干燥，以掌握含水量，当萎蔫至含水量达到70%左右(过夜)进行青贮。各供试乳酸菌用Modified Sholtens’ Broth(MSB液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，吐温-80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1000 mL，调pH值至6.2～6.4，121℃灭菌30 min)培养至对数生长期，调浓度为1×109cfu/mL，按5 mL/kg青贮原料添加，即5×106cfu/g。试验设9个处理：肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7组(B1-7)；戊糖片球菌B2-3组(B2-3)；植物乳杆菌B3-1组(B3-1)；屎肠球菌B5-2组(B5-2)；发酵乳杆菌E2-3组(E2-3)；不添加乳酸菌的MSB液体培养基为对照组(CK)。

将菌液用灭菌喷壶均匀喷洒于切碎的玉米秸秆上混匀。按500 g/袋装入22 cm×28 cm聚乙烯包装袋中，按紧、压实，利用DZ-300A多功能真空封口机(温州卓越机电有限公司)抽气封口，每个处理30个重复。于恒温环境(20℃)中进行发酵，分别在青贮第3，7，15，30天取样，每处理每次随机取3袋；于青贮第30天时将剩余青贮袋打开暴露于氧气中，分别在开袋后第1，3，7，15，30天取样，每处理每次随机取3袋，进行微生物计数及青贮饲料pH值测定。

1.3微生物计数及结果统计

采用四分法准确称取25 g样品，加入225 mL的无菌生理盐水，37℃恒温摇床摇动2 h后做10倍梯度稀释，选择3个合适连续的稀释度，每稀释度取0.1 mL涂平板，2个重复。乳酸菌的计数用MSB培养基平板[14]，将接种好的培养皿用封口膜密封好后置于37℃培养3 d后统计菌落数；细菌计数采用普通琼脂培养基平板，接种好置于37℃培养24 h后统计菌落数；酵母计数采用孟加拉红培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)平板、霉菌计数采用葡萄糖麦芽浸膏培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)平板，接种后置于25℃培养3 d后统计菌落数[15]。

1.4青贮饲料pH测定

采用四分法称取25 g样品，加入225 mL的无菌生理盐水，4℃浸泡12 h后用酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)测定样品pH。

1.5统计分析

用SPSS 18.0软件对试验数据进行方差分析，并用Duncan法对平均值进行多重比较。

2结果与分析

2.1全株玉米青贮原料中微生物数量及pH

全株玉米灌浆期收割，立即切割成2～4 cm左右，带回实验室测定水分含量，晾晒至含水量达到70%左右，青贮前采样检测原料中微生物数量和pH。结果发现，青贮原料中好氧细菌数量最多，达到(6.50±1.2)×106cfu/g；乳酸菌和酵母菌次之，分别为(8.61±0.72)×105和(9.62±1.5)×105cfu/g；霉菌较少，为(6.53±1.6)×103cfu/g；pH值为5.55，适合各种有益或有害的微生物生长繁殖。

2.2添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期乳酸菌数量的影响

由表1可见，在青贮第3天，各处理组和对照组乳酸菌数量快速增加，其中B1-7处理组和B5-2处理组乳酸菌繁殖较快，均在4×107cfu/g以上，与对照组差异显著(P<0.05)。各组乳酸菌数量在第7天时达到最大，各处理组乳酸菌数量均达到108数量级以上，而对照组乳酸菌数量达到107数量级，各处理组与对照组之间差异显著(P<0.05)。此后乳酸菌数量逐步减少，第30天时各处理组乳酸菌数量降为106数量级，对照组为105数量级，各处理组乳酸数量均显著大于对照组，其中B3-1处理组显著大于其他处理组(P<0.05)。有氧暴露期间各处理组和对照组的乳酸菌数量持续减少，有氧暴露第30天时处理组乳酸菌数量下降为105数量级、对照组为103数量级，各处理组均显著高于对照组，其中B3-1处理组的乳酸菌数量显著高于其他处理组(P<0.05)。

2.3添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期好氧细菌数量的影响

由表2可见，青贮初期各处理组和对照组的好氧细菌数量均不同程度增加，至第7天达到最大，其中只有B3-1处理组好氧细菌数量增加最少，且于第3天即达到最大，与对照组和其他处理组差异显著(P<0.05)。之后各处理组和对照组的好氧细菌数量逐渐减小，至青贮第30天时减到最小，B3-1处理组最小。整个青贮期各处理组好氧细菌数量均小于对照组，差异显著(P<0.05)。有氧暴露后，各处理组和对照组的好氧细菌数量均逐渐增加，于第7天时最大，达到107数量级。整个有氧暴露期各处理组好氧细菌数均明显小于对照组(P<0.05)，其中B3-1处理组始终最小。

表1　添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期乳酸菌数量的影响

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: The different letters in the same row mean significant differences atP<0.05, the same below.

表2　添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期好氧细菌数量的影响

2.4添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期酵母菌数量的影响

由表3可见，青贮初期各处理组和对照组的酵母菌数量均不同程度增加，至第3天达到最大。之后各处理组和对照组的酵母菌数量逐渐减小，至青贮第15天时减到103数量级，其中B3-1处理组最小，与对照组和其他处理组差异显著(P<0.05)，第30天均检测不到。整个青贮期各处理组酵母菌数量均小于对照组，差异显著(P<0.05)。有氧暴露后，各处理组和对照组的酵母菌数量均逐渐增加，于第3天达到103数量级即可检测到，30 d时最大，达到107数量级。整个有氧暴露期各处理组酵母菌数量均明显小于对照组(P<0.05)，其中B3-1处理组始终最小，增加最为缓慢。

2.5添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期霉菌数量的影响

青贮初期各处理组和对照组的霉菌数量差异不明显，随着青贮发酵的进行，霉菌数量逐渐减少，在第7天时各组霉菌数量均小于1×102cfu/g。有氧暴露后最初7天，各组的霉菌数量均小于1×102cfu/g，之后快速增加，至第15天对照组达到2.44×105cfu/g，各处理组均比对照少，差异显著(P<0.05)，其中B3-1处理组只有对照的27.17%。第30天时对照组霉菌数量达到2.48×108cfu/g，显著高于各处理组(P<0.05)，B3-1处理组的霉菌数量显著低于其他处理组(表4)。

表3　添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期酵母菌数量的影响

表4　添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期霉菌数量的影响

2.6添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期pH的影响

青贮期和有氧暴露期全株玉米青贮饲料的pH变化见表5，随着青贮的进行，各处理组和对照组的pH均下降，青贮第3天时各处理组的pH均降到4.0以下，与对照组差异显著(P<0.05)，对照组于第7天时也降至4.0以下，至青贮第30天一直保持相对稳定，整个青贮过程中，B3-1处理组pH下降最快，最低。有氧暴露后各组pH均有所升高，暴露前7 d各处理组pH上升较为缓慢，只有对照组pH升至4.0以上，上升速度较快。第30天时只有B3-1处理组pH依然在4.0以下，其余各组均升至4.0以上，对照组升至4.69。

表5　添加乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露期pH的影响

3讨论

在作物表面正常附生着大量的微生物，有些是对青贮有利的，比如乳酸菌，但更多是有害的，比如腐败菌、酵母菌和霉菌等。因此，要想获得品质优良的青贮饲料，需要青贮原料中的乳酸菌至少达到105cfu/g(鲜质量)[16]。通常，秸秆类作物表面附生的乳酸菌较少，且不一定适合青贮，虽然在本试验中乳酸菌达到8.61×105cfu/g，但同时，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量也很巨大，分别达到6.50×106,9.62×105和6.53×103cfu/g，可能是因为玉米秸秆切割后萎蔫过夜的过程中繁殖所致，这可能会造成营养物质损耗，表明需要改进降低水分含量的方法，减少萎蔫时间。

全株玉米是制作青贮饲料的主要原料，其含糖量较高，青贮较容易，但开窖后容易发生二次发酵，引起青贮饲料腐烂变质，在青贮过程中加入乳酸菌制剂可以提高其青贮发酵品质和有氧稳定性[17]。在青贮过程中，添加乳酸菌的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组，而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组，pH亦低于对照组，说明添加的各乳酸菌均能很好的定植和繁殖，通过产生乳酸抑制有害微生物的繁殖。其中B1-7处理组和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多，可见肠膜明串珠菌B1-7和屎肠球菌B5-2在好氧期繁殖最快。这与Stoked和Chen[18]及Kung和Sheperd[19]的结果一致，肠膜明串珠菌和屎肠球菌在青贮发酵早期迅速生长繁殖，从而为乳酸杆菌的生长创造适宜的条件。但其pH并没有B3-1处理组低，说明产酸不是最快的，主要是因为肠系膜明串珠菌和屎肠球菌都是异型发酵乳酸菌。从青贮第7天开始到第30天，始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低，表明植物乳杆菌B3-1产酸能力最强，耐酸性最好，最具青贮潜能。

有氧暴露后，各处理组和对照组乳酸菌总数随暴露时间延长逐渐减少，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量逐渐增多，pH逐渐升高，但添加乳酸菌的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组，pH亦低于对照组，表明添加的各乳酸菌能不同程度提高全株玉米青贮饲料有氧稳定性。其中B3-1处理组在有氧暴露的30 d内乳酸菌总数始终最多，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低，与对照组差异显著，表明植物乳杆菌B3-1在提高全株玉米青贮饲料有氧稳定性方面最具潜能。一些研究报道同型乳酸菌发酵提高了青贮发酵的品质，但是在青贮窖打开后，同型乳酸菌发酵不能有效限制酵母菌和霉菌等腐败菌的繁殖，青贮饲料的有氧稳定性降低[20-21]。本研究结果与之不同可能是因为植物乳杆菌B3-1对供试的金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌和酵母菌都具有较强的抑菌活性[13]，在有氧环境下，通过抑菌物质抑制有害微生物的活动，减少了二次发酵，但其具体的作用机制还不清楚，有待进一步探讨。

pH的高低是决定青贮是否成功的重要指标，pH在4.0以下，青贮饲料品质优等；pH 4.1～4.3，品质良好；pH 4.4～5.0，品质一般；pH在5.0以上，品质劣等[22]。在本试验中，添加乳酸菌的各处理组于青贮第3天pH均降至4.0以下，而对照组pH为4.21，表明添加乳酸菌可更快产生乳酸，抑制有害微生物的生长，有利于青贮饲料营养价值的保存。对照组于第7天也降至4.0以下，并在此后的青贮过程中各处理组和对照组一直处于4.0以下，均为优等青贮饲料。有氧暴露后，各处理组和对照组的pH随时间延长均有所升高，但各处理组pH始终低于对照组，于第30天，只有B3-1处理组pH还低于4.0，为优等青贮饲料，而对照组pH已达到4.69，品质一般。

4结论

添加乳酸菌能有效地增加青贮过程和有氧暴露后饲料中乳酸菌的数量，减少好氧细菌、酵母菌和霉菌数量，降低pH，具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力，其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。但是，植物乳杆菌B3-1能否作为优良全株玉米青贮接种剂，还需要检测其对青贮饲料营养成分的影响，再进行综合判定，我们将后续报道。

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Effect of lactic acid bacteria on corn silage quality and stability after aerobic exposure

WAN Xue-Rui1, WU Jian-Ping2, LEI Zhao-Min2*, HE Yi-Qun1, WU Run1

1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:To investigate the effect of lactic acid bacteria (LAB) with antibacterial activity on the number of LAB, aerobic bacteria, yeasts and molds and pH of whole corn silage during fermentation and aerobic exposure, 5 LAB strains collected from corn silage across Gansu were added to whole corn silage. The results showed that the number of LAB was significantly increased by adding LAB to silage and the number of aerobic bacteria, yeasts and molds significantly reduced and pH reduced after addition of Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides B1-7, Pediococcus pentosaceu B2-3, Lactobacillus plantarum B3-1, Enterococcus faecium B5-2 and Lactobacillus fermentum E2-3 compared with the control (no LAB added). At the beginning of fermentation the number of LAB in B1-7 and B5-2 treatments was highest. After aerobic exposure (7 to 30 days),the number of LAB was highest, aerobic bacteria, yeasts and molds lowest, and pH lowest in the B3-1 strain treatment. These results indicate that all added LAB had a potential role in improving the quality of silage and aerobic stability but L. plantarum B3-1 was the most effective.

Key words:whole corn; silage; Lactobacillus plantarum B3-1; pH

*通信作者

Corresponding author. E-mail：leizm@gsau.edu.cn

作者简介：万学瑞(1979-)，女，甘肃白银人，讲师，博士。E-mail：383921499@qq.com

基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW. 2012-25)，农业部公益性行业科研专项(201503134，20130305907)，甘肃省科技支撑计划(1204NKCA103)，甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1232)和兰州市科技发展计划(2012-2-159)资助。

*收稿日期：2015-09-01；改回日期：2015-11-02

DOI：10.11686/cyxb2015397

http://cyxb.lzu.edu.cn

万学瑞, 吴建平, 雷赵民, 何轶群, 吴润. 优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响. 草业学报, 2016, 25(4): 204-211.

WAN Xue-Rui, WU Jian-Ping, LEI Zhao-Min, HE Yi-Qun, WU Run. Effect of lactic acid bacteria on corn silage quality and stability after aerobic exposure. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 204-211.