黄体酮对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞微管相关蛋白-1B的影响

白瑜 杜丽敏 赵平

·论著·

黄体酮对视神经损伤大鼠视网膜神经节细胞微管相关蛋白-1B的影响

白瑜 杜丽敏 赵平

目的 观察并探讨黄体酮对视神经损伤早期视网膜神经节细胞微管相关蛋白-1B的影响，以期为黄体酮在视神经保护方面的作用提供实验依据。方法 60只大鼠随机分为3组,每组20只。正常对照组不做任何处理，损伤1组制作右眼视神经夹伤模型，给予0.9%氯化钠溶液腹腔注射，损伤2组制作右眼视神经夹伤模型，给予黄体酮腹腔注射。分别于损伤后1、3、7、14、28 d将3组大鼠右眼球摘除, 取视网膜组织, HE染色光学显微镜观察视网膜形态学变化，并计数视网膜神经节细胞存活数量,免疫组织化学染色观察视网膜组织中 MAP-1B在视网膜神经节细胞的表达情况。结果 视神经损伤后损伤1组视网膜神经纤维层明显水肿，视网膜神经节细胞数目迅速减少，经黄体酮治疗的损伤2组视网膜形态改变轻微，视网膜神经纤维层轻度水肿，视网膜神经节细胞数目减少缓慢。损伤2组各时间段视网膜MAP-1B平均光密度值较损伤1组高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 黄体酮可以通过增加细胞骨架蛋白MAP-1B减轻视神经损伤早期视网膜神经节细胞的损害，对视神经及视网膜有保护作用。

黄体酮;视神经损伤;视网膜神经节细胞;微管相关蛋白质类

随着外伤事件的逐年增多，视神经损伤，现在临床多称为外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)，已成为现代社会中致盲的重要因素及眼科学者的研究热点。视神经损伤后视功能下降的病理基础是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的进行性变性、凋亡及其轴突的溃变和坏死。因此，减缓RGCs的变性、凋亡以及促进其轴突再生成为治疗本病的关键所在[1]。黄体酮(progesterone,PROG)作为一种性激素已广泛应用于妇产科临床，近年来大量研究证实，它在抑制中枢神经系统损伤后神经细胞的凋亡、促进受损神经元髓鞘生成，保护中枢神经系统方面也具有良好的作用，但其对于视神经损伤的作用报道较少[1，2]。微管相关蛋白(microtubule associated protein-1B，MAP-1B)是轴突生长和维持细胞骨架正常形态所必需的一种非常重要的细胞骨架蛋白[1]，在视神经损伤后RGCs的存活和轴突再生中起着重要的作用[2]。本研究通过建立大鼠视神经损伤模型，观察腹腔注射PROG对视神经损伤早期RGCs的保护作用及其对视神经损伤后视网膜MAP-1B表达的影响，从而为黄体酮治疗视神经损伤的临床应用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康成年雄性SD大鼠60只，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(冀2012-3-05)。体重(200±20)g，行外眼及眼底检查无病变者纳入实验。选择右眼为实验眼，随机分为正常对照组(不做任何处理)、损伤1组(右眼行视神经不全损伤处理，伤后每日腹腔注射0.9%氯化钠溶液10.0 mg/kg)、损伤2组(右眼行视神经不全损伤处理，伤后每日腹腔注射PROG 10.0 mg/kg)，每组20只。

1.2 实验试剂 黄体酮注射液(上海通用药业股份有限公司)，SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)DAB检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)MAP-1B抗鼠单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 视神经损伤模型制作[3]:损伤1组及损伤2组均于术前3 d用抗生素眼水、眼膏点眼。正常对照组大鼠不做任何处理。2损伤组大鼠用5%水合氯醛7 ml/kg 腹腔注射麻醉成功后，将实验组大鼠取俯卧位固定于手术台上，消毒铺巾，取右眼为实验眼，在手术显微镜下沿角巩膜缘弧形向上沿鼻侧剪开球结膜，钝性分离眼眶组织直达视神经，在距球后2 mm处，用压力恒定的反向颞夹持视神经20 s造成视神经不全损伤，用10-0尼龙线缝合球结膜2针，结膜囊内涂盐酸洛美沙星眼膏。术眼瞳孔散大固定、直接光反射消失为成功模型，否则剔除。

1.3.2 HE染色及免疫组化染色:2损伤组每日腹腔注射PROG 10.0 mg/kg，以0.9%氯化钠溶液稀释，正常对照组给予0.9%氯化钠溶液 10.0 mg/kg腹腔注射。分别于术后第1、3、7、14、28天经多聚甲醛心脏灌注后立即摘取右眼眼球及部分视神经放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h取出，平行于眼球矢状轴并通过视神经做视网膜组织5 μm连续切片3张，HE染色光学显微镜观察RGCs的形态及数量变化。免疫组织化学染色观察视网膜组织中MAP-1B的表达变化，计算机图像分析进行半定量检测平均光密度值(verage optical density,AOD),以免疫阳性染色的AOD值来表示抗原表达量，AOD值越高则阳性表达越强。

2 结果

2.1 RGCs形态的改变 正常对照组大鼠视网膜HE染色可见3层细胞核，从玻璃体向巩膜依次为RGCs层、双极细胞层、感光细胞层。视网膜神经节细胞层的细胞呈单层排列，大小不一，轮廓不规则，细胞边界较清晰。从胞核形态学可以分为大而浅染的细胞核以及小而深染的细胞核，后者居多。损伤1组可见视网膜神经纤维层水肿，损伤早期部分神经节细胞出现水肿及空泡样改变，另有部分细胞出现核溶解以及胞浆淡染。损伤2组视网膜形态改变较损伤1组轻，视网膜神经纤维层仅轻度水肿，损伤早期细胞形态大致正常，只有少部分出现核溶解及胞浆淡染，晚期神经节细胞才出现水肿及空泡样改变。见图1～3。

2.2 RGCs数量的改变 视神经损伤后2损伤组RGCs数目均呈下降趋势，14 d以前RGCs呈快速减少，14 d以后RGCs减少速度变缓，1～28 d各时间段损伤2组的RGCs数目高于损伤1组，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)，2损伤组各时间段RGCs数目均低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1，图4。

表1 不同时期各损伤组RGCs数量 n=20,个,

注：正常对照组RGCs数量: 29.90±0.54

表1 3d时损伤1组视网膜(HE×400)表2 3d时损伤2组视网膜(HE×400)表3 7d时损伤1组视网膜(HE×400)

图4 3组不同时期RGCs的数量

2.3 视网膜MAP-1B免疫组化染色结果 正常对照组大鼠视网膜中MAP-1B强阳性呈棕黄色，主要表达于光感受器内节；弱阳性呈淡黄色，主要表达于少数RGCs胞浆和光感受器外节。视神经损伤后3 d后，RGCs MAP-1B呈棕黄色阳性表达，主要分布于RGCs的胞浆，而内核层细胞胞浆呈淡黄色弱阳性表达。损伤1组和损伤2组MAP-1B在各时间点的表达。见图5～13。

表5 7d时损伤1组视网膜(HE×400)图6 3d时损伤1组视网膜MAP-1B(免疫组化×400) 图7 3d时损伤2组视网膜MAP-1B(免疫组化×400)

图8 7d时损伤1组视网膜MAP-1B(免疫组化×400) 图9 7d时损伤2组视网膜MAP-1B(免疫组化×400) 图10 14d时损伤1组视网膜MAP-1B(免疫组化×400)

2.4 视网膜MAP-1B免疫组化半定量检测结果 视神经损伤后3 d时损伤1组和损伤2组RGCs层MAP-1B阳性表达增加，损伤1组7 d时MAP-1B表达最强，高于同组其他时间段，差异有统计学意义(P<0.05)，14 d时表达明显减弱。损伤2组14 d内MAP-1B的表达逐渐增强，14 d时最强，明显高于同组其他时间段(P<0.05)，表达部位同正常对照组。2个损伤组28 d时MAP-1B的表达明显减弱，且2组差异无统计学意义(P>0．05)。损伤1组与损伤2组的RGCs层MAP-1B平均光密度值均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图14。

图11 14d时损伤2组视网膜MAP-1B(免疫组化×400) 图12 28d时损伤1组视网膜MAP-1B(免疫组化×400) 图13 28d时损伤1组视网膜MAP-1B(免疫组化×400)

表2 半定量检测不同时期视网膜表达MAP-1B 的光密度值 ±s

注：正常对照组视网膜表达MAP-1B光密度值:0.0744±0.0216；与其他时间比较，*P<0.05

图14 不同时期损伤1组及损伤2组视网膜MAP-1B平均光密度值

3 讨论

视神经损伤后RGCs的丢失在大量动物实验中曾得到过详尽的研究[4-6]。局部轴突的断裂、细胞骨架破坏导致的轴浆运输障碍，以及局部血液循环障碍导致的组织缺血、缺氧是引起RGCs变性、凋亡的重要因素[7]。因此，如何促进神经轴突再生成为保护RGCs，提高视功能的关键所在。研究表明，神经细胞能够维持正常生理功能，依赖于轴浆在胞体和轴突末梢之间流动所进行的物质的运输和交换，而轴突细胞骨架是维持轴突正常形态结构同时也是维持轴浆正常流动的重要亚细胞结构[6]。细胞骨架的破坏是视神经损伤后首先出现的超微改变之一，也是影响神经轴突再生的主要因素之一。

MAP-1B是一种非常重要的细胞骨架蛋白，是微管间横桥的重要成分，它在生长的神经突起中表达丰富，是轴突生长所必需的。研究表明，神经损伤后轴突的伸长主要是通过微管的延伸来实现的，神经丝随着微管的延伸而生长，而MAP-1B是微管间“桥”的主要成份，使微管稳定聚合成束，从胞体延伸到轴突末端，促进轴突的再髓鞘化[8-10]。MAP-1B主要分布于神经元胞体、 核周及其延伸的轴突上, 在成年视网膜主要集中于光感受器细胞(视锥细胞与视杆细胞)内节和外节也有少许分布。MAP-1B有多个磷酸位点，经磷酸化修饰后才能发挥其生物活性，其主要有2种磷酸化形式PI-MAP-1B和PII-MAP-1B。MAP-1B及其磷酸化亚型(MAP-1B-P)广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统,并在神经生长和再生中扮演重要角色[11-13]。所以，在实验研究中MAP-1B被经常作为神经保护类药促进神经髓鞘再生程度及对神经元保护作用的衡量标准[14,15]。

PROG是一种激素类神经类固醇，既往多用于治疗妇产科疾病。近年研究发现，PROG能够很好的促进受损神经髓鞘再生。Labombarda 等[16]通过对脊髓损伤大鼠模型的研究发现PROG可以提高脊髓损伤后新半乳糖白蛋白2和髓磷脂碱蛋白的细胞数量,从而促进神经髓鞘形成。Schumacher等[17]研究证明了在中枢神经系统内产生髓鞘的少突胶质细胞中,PROG可以通过增加髓磷脂碱基蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达量从而促进髓鞘形成。Ghoumari等[18]更是对PROG在髓鞘形成和再生过程的重要作用做了详细的阐明。而本研究结果显示，视神经损伤后，RGCs内MAP-1B表达量增高。经过PROG治疗的损伤2组与损伤1组相比，在各时间段，MAP-1B表达强度都明显增高。说明PROG可能通过增加MAP-1B生成而起到促进受损视神经髓鞘再生的作用。

同时大量研究表明，PROG也可以通过抑制神经系统炎性介质[19]、减轻神经细胞离子间失衡[20]、稳定细胞Na+-K+-ATP酶[21]、降低组织NO水平、减少神经毒性介质的释放[22]等多种途径起到保护神经的作用。这在本实验中，通过观察视神经损伤后RGCs数目发现：应用PROG后，不仅减缓了视神经损伤早期RGCs数目的下降程度，而且增加了损伤末期RGCs的存活数量。进一步证实了PROG保护视神经的作用。

1 Beat M,Riederer E.Microtubule-associated protein 1B, a growth-associated and phosphorylated scaffold protein. Brain Research Bulletin,2007,71:541-558.

2 Daniela C,Trivedi N,Engelmann R,et al.Partial regeneration and long-term survival of rat retinal ganglion cells after optic nerve crush is accompanied by altered expression, phosphorylation and distribution of cytoskeletal proteins. European Journal of Neuroscience,2002,15:1433-1443.

3 黄厚斌,马志中,张卯年.大鼠视神经部分损伤后视神经纤维再生的形态学观察.中华眼科杂志,2006,42:251-255.

4 祁晓君,冯炜,张洁,等.丙戊酸钠在大鼠视神经损伤再生中的作用研究及对BDNF表达的影响.中华眼外伤职业眼病杂志,2014,36:488-491.

5 黄晓瑛,赵平.米诺环素对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞和小胶质细胞表达的影响.中华眼外伤职业眼病杂志,2013,35:481-484.

6 刘晓坤,张晓宇,王赟,等.米诺环素对大鼠视神经挫伤后视网膜Caspase-3表达的影响. 眼科新进展,2013,33:1132-1135.

7 Wells J,Matthew R,Jeremy A,et al.Early In Vivo Changes in Calcium Ions,Oxidative Stress Markers,and Ion Channel Immunoreactivity Following Partial Injury to the Optic Nerve. Journal of Neuroscience Research,2012,90:606-618.

8 Tint I,Fischer I,Black M.Acute Inactivation of MAP1b in Growing Sympathetic Neurons Destabilizes Axonal Microtubules.Cell Motility and the Cytoskeleton,2005,60:48-65.

9 Thomas B,Sheat M,Beermann L.Respective Roles of Neurofilaments, Microtubules,MAP1B, and Tau in Neurite Outgrowth and Stabilization.Molecular Biology of the Cell,1994,5:863-875.

10 Jonathan G,Peter K,Fiona B,et al.The protein MAP-1B links GABA(C) receptors to the cytoskeleton at retinal synapses.NATURE,1999,397:66-69.

11 Pinzon Duarte G,Arango Gonzalez B,Guenther E,et al.Effects of brain-derived neurotrophic factor on cell survival,differentiation and patterning of neuronal connec-tions and Müller glia cells in the developing retina. European Journal of Neuroscience,2004,19: 1475-1484.

12 Franzen R,Sandra L,Suzanne M,et al.Microtubule-associated protein 1B: a neuronal binding partner for myelin-associated glycoprotein. The Journal of Cell Biology,2001,155:893-898.

13 Alfeia L,Soaresb S.Expression of MAP-1B protein and its phosphorylated form MAP1B-P in the CNS of a continuously growing fish, the rainbow trout.Brain Research,2004,1009:54-66.

14 唐秀武，刘金华.蛇毒神经生长因子对鼠视网膜神经节细胞微管相关蛋白-1B的影响.眼科新进展,2007,27: 808-812.

15 Gonzalez-Billaul C，Owen R，Phillip R.Gordon-Weeks,et al.Microtubule-associated protein 1B is involved in the initial stages of axonogenesis in peripheral nervous system cultured neurons. Brain Research,2002,943:56-67.

16 Labombarda F,Gonzalez S,Gonzalez Deniselle MC,et al.Progesterone increases the expression of myelin basic protein and the number of cells showing NG2 immunostaining in the lesioned spinal cord. Journal of Neurotrauma,2006,23:181-192.

17 Schumacher M, Guennoun R,Robert F,et al.Local synthesis and dual actions of progesterone in the nervous system:neuroprotection and myelination.Growth Horm IGF Research,2004,14: S18-S33.

18 Ghoumari AM,Ibanez C,El-Etr M,et al.Progesterone and its metabolites increase myelin basic protein expression in organotypic slice cultures of rat cerebellum.Journal of Neurotrauma,2003,86:848-859.

19 Chen G,Shi JX,Ding YS,et al.Progesterone prevents traumatic brain injury-induced intestinal nuclear factor kappa B activation and proinflammatory cytokines expresstion in male rats.Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation,2007,10:1155-1162.

20 Wells J,Matthew R,Jeremy A,et al.Early in vivo changes in calcium lons,oxidative stress markers,and immunoreactivity following partial injury to the optic nerve.Journa of Neuroscience. Research,2012,90:606-618.

21 Garay L,Deniselle MC,Lima A,et al.Effects of progesterone in the sp inal cord of a mouse model of multiple sclerosis. Journal of steroid biochemistry and molecular biology,2007,107:228-237.

22 白瑜,陈乾,安国禹,等.黄体酮在大鼠视神经损伤再生中的保护作用.眼科新进展,2015,35:924-928.

Effects of progesterone on the expression of MAP-1B in retinal ganglion cells of rats with optic nerve injury)

BAIYu)

*,DULimin,ZHAOPing.*DepartmentofOphthalmology,TheSecondHospitalofShijiazhuangCity,Hebei,Shijiazhuang050051,China

Objective To observe the effects of progesterone on the expression of microtubule associated protein-1B(MAP-1B)in retinal ganglion cells of rats with optic nerve injury in order to provide experimental evidence of progesterone’s protective effects on optic nerve.Methods Sixty rats were randomly divided into 3 groups,with 20 rats in each group.The rats in control group were not treated,however,the optic nerve injury models in right eye of rats were established in injury group 1,with 0.9% sodium chloride solution intraperitoneal injection,and the animal models were also established in injury group 2,with progesterone intraperitoneal injection. On 3d,7d,14d and 28d after injury, the right eyeballs of rats were excised, and retinal tissues were taken out, the morphological changes of retina were observed by HE staining, and the survival numbers of retinal ganglion cell were calculated, furthermore,the expression levels of MAP-1B in retinal ganglion cell were detected by immunohistochemistry.Results After optic nerve injury,the retinal nerve fiber layer appeared obvious edema,and the numbers of retinal ganglion cells were quickly decreased in injury group 1,however, the retinal morphological changes were alleviated,retinal nerve fiber layer appeared slight edema and the numbers of retinal ganglion cells were decreased slowly after treatment with progesterone in injury group 2.There was a significant difference in the optical density value at different time points between injury group 1 and injury group 2 (P<0.05).Conclusion Progesterone can relieve the damage of retinal ganglion cells at early period of optic nerve injury through increasing the expression levels of cytoskeleton protein-MAP-1b,thus,which has protective effects on optic nerve and retina.

progesterone; optical nerve injury; retinal ganglion cell; microtubule associated protein-1B

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.002

050051 河北省石家庄市第二医院眼科(白瑜);河北医科大学第三医院眼科(杜丽敏、赵平)

赵平，050051 石家庄市，河北医科大学第三医院眼科；

E-mail：zhpsjz@126.com

R 774.6

A

1002-7386(2016)08-1128-05

2015-12-01)