抑制鹿源多药耐药结核菌中药的筛选

姜园园，李温明，刘　畅，曾范利，时　坤，李健明，刁乃超，李仲乐，刘东旭，杜　锐,5*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.中华人民共和国铁岭出入境检验检疫局，辽宁铁岭 112616；3.长春市动植物公园，吉林长春 130022；4.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；5.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室/吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春 130118)



抑制鹿源多药耐药结核菌中药的筛选

姜园园1，李温明2，刘畅3，曾范利4，时坤4，李健明4，刁乃超1，李仲乐1，刘东旭1，杜锐4,5*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.中华人民共和国铁岭出入境检验检疫局，辽宁铁岭 112616；3.长春市动植物公园，吉林长春 130022；4.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；5.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室/吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春 130118)

摘要：为了筛选对鹿源多药耐药结核菌有效的中药耐药抑制剂，通过MABA法检测24种中药的水和乙醇提取物对多药耐药结核菌及标准菌p7Rv的体外抗菌效果，将筛选出的抗菌效果好的黄连醇提物和黄连水提物采用紫外分光光度法进行活性成分含量测定，同时以MABA法与标准品比较体外抗结核菌活性。结果显示,黄连、独活和侧柏叶有明显的抗结核活性，其中黄连水粗提物和乙醇粗提物效果最佳，测得它们活性成分即总生物碱含量分别为22.74%和35.23%，并显示二者与小檗碱的体外抗结核作用相同。

关键词：鹿；多药耐药结核菌；中药；耐药抑制剂

鹿结核病是由结核杆菌引起的鹿的慢性消耗性传染病，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见，严重威胁着养鹿业的健康发展[1]。自从1978年在新西兰的鹿场发现首例鹿结核病以来，鹿结核病相继在世界范围内的鹿场被确诊[2]。结核杆菌的宿主范围广，传染人类的同时，在动物养殖业造成重大的经济损失[3]。近年来随着耐药性结核菌株的增加，多药耐药结核病的防控已成为难题[4]。虽然过去几十年来国际上针对结核病已开发出近20种药物，但均存在毒副作用较大、易产生耐药性、病人难以耐受等缺点。中药是我国特有的丰富的自然资源，很多药物在治疗结核病方面有独特的疗效，而且不容易产生耐药性。本研究选取有抑菌作用的24种中药，分别获得它们的乙醇提取物和水提取物，筛选对鹿源多药耐药结核菌有效的中药耐药抑制剂，从而为解决动物源结核分支杆菌的耐药性问题做出了有益的探索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药物及培养基异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、链霉素(streptomycin,SM)、阿米卡星(amikaci,AM)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX) 、丙硫异烟胺(TH)、对氨基水杨酸(p-aminosalicylic acid,PAS)，均购自中国药品生物制品检定所；INH、SM用灭菌蒸馏水溶解，其余药物用DMSO溶解，充分溶解后以0.22 μm滤膜过滤，置-20℃保存备用；荆芥、细辛、黄连、金银花、连翘、紫花地丁、蒲公英、鱼腥草、夏枯草、百部、白附子、苍术、芦荟、小茴香、远志、独活、高良姜、侧柏叶、艾叶、杜仲、葱白、葎草、车前草、大蒜 24种中药购自百草大药房；二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司产品；Middlebrook7H9肉汤和MiddlebrookOADC增菌液，BD Difco 公司产品。

1.1.2试验菌株标准结核分支杆菌p7Rv、鹿源牛分支杆菌(MB-1)和结核分支杆菌(MT-7)，吉林大学于录教授惠赠。

1.2方法

1.2.1耐药性测定利用比例法[5]，参照《结核病诊断细菌学检验规程》[6]对牛分支杆菌(MB-1)和结核分支杆菌(MT-7)分别进行INH(0.2 μg/mL)、RFP(40.0 μg/mL)、EMB(2.0 μg/mL)、SM(4.0 μg/mL)、AM(8.0 μg/mL)、OFX(2.0 μg/mL)、TH(40.0 μg/mL)、PAS (0.5 μg/mL)的耐药性测定。置于37℃温箱中培养，28 d后观察培养结果。若(含药培养基菌落数/对照培养基菌落数)×100%大于1%，则认为耐药，反之为不耐药。

1.2.2乙醇提取中药称取药材粉末约20 g，用200 mL的900 mL/L的乙醇回流提取2次，之后再用750 mL/L的乙醇回流提取1次，每次约1 h，合并3次滤液，将滤液浓缩成浸膏。用DMSO溶解成20 mg/mL，置-20℃保存备用。

1.2.3水提取中药称取药材粉末40 g，用40 mL的水煎煮3次，每次约1.5 h，合并3次滤液，将其浓缩成干燥的浸膏。用DMSO溶解成20 mg/mL，置-20℃保存备用。

1.2.4中药对耐药性结核分支杆菌的MIC测定中药的MIC值的测定通过MABA显色法[7-8]。标准菌p7Rv、耐药性牛分支杆菌和耐药性结核分支杆菌以无菌7H9肉汤培养基(Middlebrook7H9∶MiddlebrookOADC=9∶1)培养至McFarland1号麦氏比浊管浓度，并无菌稀释20倍。分别以无菌7H9肉汤培养基稀释24种中药的乙醇和水提取物稀释至4倍最大期望最终检测浓度。96孔细胞板四周加280 μL蒸馏水，其余孔加入100 μL无菌肉汤培养基，然后每行第1个孔加入100 μL中药工作液，并对每行药物进行2倍系列稀释，同时每板设有药和无药对照孔。将稀释好的菌液加入所有检测孔中以及无药对照孔中, 每孔所含菌量约为8×105CFU/孔。同时, 将菌悬液进行1∶10和1∶100稀释，代表工作菌量的10% 和1% 成长。被检测药物的最终浓度从1 600 μg/mL 到6.25 μg/mL。在37℃体积分数为5%的CO2的温箱内孵育，5 d后对照孔加入20 μL的0.15 g/L刃天青和12 μL的100 mL/L Tween 80，37℃孵育1 d。若对照孔变为粉红色，所有试验孔加入上述相同的刃天青和Tween 80混合溶液，37℃孵育24 h记录结果。蓝色孔为无细菌生长，粉色孔为有细菌生长孔。最低抑菌浓度(MIC)定义为阻止颜色变化的最低药物浓度。每种药物重复2次。

1.2.5黄连总生物碱的含量测定通过核酸染料法[9-10]测定黄连总生物碱的含量。

1.2.5.1对照标准品的制备称取适量的盐酸小檗碱，用pp.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容后的浓度为92.0 μg/mL。

1.2.5.2标准曲线的制备分别精密吸取对照标准品0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，加入pp.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液至4 mL，再加入3 mL溴甲酚绿和10 mL的氯仿，剧烈震摇3 min，静置20 min取氯仿液做标准曲线，无对照标准品的氯仿液做空白对照。取小檗碱1 mL，按上述方法制备氯仿液，在300 nm～700 nm波长范围扫描，结果在417 nm有最大吸收值。

1.2.5.3样品含量的测定将黄连水提物和醇提物的浸膏溶解成100 μg/mL，各取0.5 mL，按与标准品相同的方法制备氯仿液，根据小檗碱的标准曲线测定样品总生物碱的含量。

1.2.6黄连总生物碱与标准品(小檗碱)体外抗结核菌活性测定，测定黄连总生物碱与标准品MIC方法同1.2.4。黄连总生物碱的浓度和小檗碱的浓度均从400 μg/mL 到1.06 μg/mL。

2结果

2.1耐药性测定

经检测鹿源牛分支杆菌MB-1对一线药物INH、REP和SM表现为耐药，对二线药物PAS、AM和OFL表现为耐药；结核分支杆菌MT-7对一线药物INH、REP和SM表现为耐药，对二线药物PAS和OFL表现为耐药，证明2株鹿源结核菌均为多药耐药结核分支杆菌(表1)。

表1　MB-1和MT-7对8种药物耐药性检测结果

注：S.敏感；R.耐药。

Note: S.Sensitive；R.Resistance.

2.2中药对耐药性结核杆菌的MIC测定

从24种中药的水提物、醇提物中筛选出抗p7Rv、MB-1、MT-7效果明显的有4种，即黄连水提物、黄连醇提物、独活醇提物、侧柏叶醇提物。测得黄连水提物的MIC值均小于200，黄连醇提物的MIC值均小于100，独活醇提物的MIC值均在400，侧柏叶醇提物的MIC值均为400(表2)。其余中药提取物抗p7Rv、MB-1、MT-7的效果不明显，其MIC值均大于800。

2.3黄连总生物碱的含量测定

经光谱扫描，在417 nm有最大吸收值(图1)，以盐酸小檗碱标准品浓度为横坐标，以对应吸光光度值为纵坐标得到的回归方程为y=0.042x+0.113, r=0.999 4(n=6) (图2)，结果表明,盐酸小檗碱在3.68 μg/mL～22.8 μg/mL的范围内呈良好的线性关系。黄连水提物的总碱含量为22.74%，黄连醇提物的总碱含量为35.25%。

表2　部分中药提取物对p7Rv、MB-1和MT-7的MIC检测结果

图1　波长扫描图

图2　小檗碱标准曲线

2.4黄连总生物碱与标准品(小檗碱)体外抗结核菌效果

黄连水提物、醇提物与小檗碱抗p7Rv、MB-1、MT-7 的MIC值均小于200，且黄连醇提物与小檗碱的MIC值相同，两者的MIC值均低于黄连水提物的MIC值，体外抗菌效果较好(表3和图3)。

表3　p7Rv、MB-1和MT-7的黄连水提物、

1、2.黄连水提物;3、4.小檗碱;5、6.黄连醇提物

1,2.Aqueous extracts fromCoptidisrhizome;3,4.Berberine;5,6.Ethanol extracts fromCoptidisrhizome

图3黄连水提物、醇提物与小檗碱抗结核菌对比

Fig.3The experimental results by comparison of aqueous and ethanol

extracts fromCoptidisrhizomeand berberine antitubercular activity

3讨论

养鹿业是吉林省的特色产业，但由于抗结核化学药物的广泛应用，人结核病的暴发流行以及耐药性结核分支杆菌的不易治疗，使得鹿结核病发病率逐年增加，严重阻碍了吉林省乃至我国养鹿业的健康发展。因此，寻找新的有效药物治疗结核病迫在眉睫。中药在治疗结核病方面具有西药不可代替的优势。检测结核杆菌的耐药性的方法有绝对浓度法[6]、比例法[5]及BACTEC460系统[10]等, 其中绝对浓度法是我国常用的检测方法；比例法是WHO/IUATLD推荐在全球使用的结核菌耐药监测方法，此方法操作规范，结果准确，容易进行国际间的交流。国内外还有采用微孔板[11]检测结核分支杆菌的MIC值，包括微量稀释[12]MABA所需的培养基少，容易直观观察。本研究采用比例法来检测结核杆菌的耐药性，结果无论结核分支杆菌还是牛分支杆菌均对一线药物的INH、RFP、SM产生耐药性，对二线药物的PSA、OFX均产生耐药性，说明临床分离出的结核杆菌多为多药耐药的结核分支杆菌。参照《中国药典》选择24种中药，用单味草药的提取物来观察对耐药性结核分支杆菌的生物学作用，结果表明，只有3种对多药耐药结核分支杆菌有明显的抑制作用，其中以中药黄连效果最为明显。

黄连主要含有生物碱，以小檗碱(黄连素)为主，其次为黄连碱、掌叶防己碱(巴马亭)、药根碱、表小檗碱、甲基黄连碱、非洲防已碱、木兰花碱等。因此本研究以小檗碱为标准对照品，与黄连水提物和醇提物进行比较。结果黄连醇提物对抗p7Rv、MB-1、MT-7的效果与小檗碱的效果相同，两者均比黄连水提物的效果好。通过对黄连浸膏中总生物碱含量测定，结果显示，黄连醇提物的总碱含量高于黄连水提物的总碱含量。并且获得黄连醇提物的成本低，操作简便，不需要大量的仪器，该活性成分若能应用于临床或作为中药药物添加剂广泛应用，必将对解决动物源结核菌耐药性问题提供新的思路。

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Screening of Drug Resistance Inhibitors from Chinese Herbal Medicines for Multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisfrom Deer

JIANG Yuan-yuan1,LI Wen-ming2,LIU Chang3,ZENG Fan-li4,SHI Kun4,LI Jian-ming4,DIAO Nai-chao1,LI Zhong-le1,LIU Dong-xu1,DU rui4,5

(1.CollegeofAnimalScience&Technology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;2.LiaoningEntry-exitInspectionandQuarantineofthePeople'sRepublicofChina,Tieling,Liaoning,112616,China;3.ChangchunZoologicalandBotanicalPark,Changchun,Jilin,130022,China;4.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;5.KeyLaboratoryofAnimalProductionandtheProductQualityandSafety,MinistryofEducationJilinProvinceSikaDeerProductionandApplicationLab,Changchun,Jilin,130118,China)

Abstract:In order to screen drug resistance inhibitors from Chinese herbal medicines for deer multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis in vitro,24 kinds of Chinese herbal medicines extracted with water and ethanol were applied to detect sensitivity to multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis and p7Rv by MABA method.The aqueous and ethanol extracts of Coptidis rhizoma were testified to detect its active ingredient concentration by UV and compared with standard variety by MABA method.The date clearly demonstrated that Coptidis rhizoma，Angelicae pubescentis radix and Platycladi cacumen showed greater antimicrobial activity against drug-resistance Mycobacterium tuberculosis and p7Rv.Content of total alkaloid of aqueous and ethanol extracts were 22.74% and 35.23%,respectively.The antibacterial effects of extracts from Coptidis rhizoma were identical to berberine.

Key words:deer;multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis;Chinese herbal medicine;drug resistance inhibitor

文章编号:1007-5038(2016)04-0054-04

中图分类号:S853.69

文献标识码:A

作者简介：姜园园(1990-)，女，吉林四平人，硕士研究生，主要从事经济动物疫病研究。*通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(31372436)；吉林省科技厅科技成果转化促进计划项目(20140309018YY)；吉林省科技厅科技创新人才培育计划项目(20130521023JH)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204028NY)

收稿日期：2015-09-24