大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性*



大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性*

0引言

【研究意义】α-淀粉酶作为一种重要的工业用酶[1]，目前已广泛应用于焙烤、啤酒酿造、纺织退浆、制药等行业中[2-5]。普通的淀粉酶作为生物催化剂，效率高但所需条件温和，在强酸、强碱、高盐等极端环境下耐受性差,易变性失活；而极端酶却能在这种残酷的环境下依然保持高效的催化能力。因此，研究、挖掘极端酶，开发其潜在的应用价值就具有重要的意义。【前人研究进展】目前对于嗜盐α-淀粉酶的嗜盐机理，主要存在两种理论：一是在高浓度的离子环境中，通过特定位置上的一些关键离子相互作用及其与水形成的巨大水网络来稳定蛋白质的空间结构[6]；二是通过弱疏水的内核与酸性的、高离子化的蛋白表面作为其在环境中的平衡因子来维持它们在高盐环境下的正确折叠等[7]，这与Alteemark[8]、Madern[9]、Kastritis[10]、Nonaka[11]等在嗜盐酶方面的研究结果基本吻合。【本研究切入点】本文研究的嗜盐α-淀粉酶基因来自于非嗜盐菌Escherichia coli JM109，在高盐环境下依然能保持稳定的结构和高效的生物催化能力，这在食品腌制、调味剂等的工业生产及盐碱地的改造等多方面都具有开发利用价值[12]。因此，我们参照上述的研究结果，通过同源建模，选定嗜盐α-淀粉酶定点突变的位置及替换氨基酸k6-P368G,并研究其相关的酶学特性。【拟解决的关键问题】研究嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性是否与Na+结合位点具有直接的联系，探索嗜盐α-淀粉酶嗜盐的分子机理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa公司)，DpN Ⅰ(TaKaRa公司)，金属镍亲和层析介质(phamacia公司)，IPTG(CALBIOCHEM公司)，麦芽糖及其麦芽三糖为色谱纯，Lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)，其他试剂为国产分析纯。

1.1.2菌种和质粒

宿主大肠杆菌E.coli JM109及其表达载体pSE380均为实验室保藏菌种。

1.2方法

1.2.1引物设计

根据已有的大肠杆菌JM109嗜盐淀粉酶基因序列，再参照前面所述的嗜盐淀粉酶定点突变位点的选择，设计引物(P1：5′-TTCTATGGCGACCTCTACGGTGCGCAT-3′；P2：5′-GAGGTCGCCATAGAATACCGAAGGAAC-3′)，反向定点扩增目的基因。

1.2.2定点突变基因的扩增

从含有嗜盐α-淀粉酶基因k6的pSE380-K6菌株中提取重组质粒作模板，以P1、P2为引物，扩增点突变目的基因k6-P368G，其扩增体系为50 μL，扩增条件为：98℃预变性3 min，98℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸90 s，循环29次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3重组表达载体的构建及其目的蛋白的表达纯化

将验证后的PCR扩增产物胶回收，DpNⅠ酶消除模板。利用化学转化法，将纯化的点突变产物转入到宿主细胞JM109中并测序验证。将点突变成功的菌种接种到LB(含100 mg/L的Amp)培养基中，37℃恒温摇床培养，当OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂IPTG，在30℃恒温摇床中继续培养10 h，进行目的蛋白的诱导表达。离心已培养好的发酵液，收集菌体，用中性磷酸-柠檬酸缓冲液重悬菌体，清洗两次，然后再用10 mmol/L的Lysis buffer(缺少NaCl成分)重悬菌体，在冰浴条件下超声波破胞。最后离心破胞液，收集上清，利用金属镍亲和层析纯化目的蛋白，并进行SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白的纯化效果。

1.2.4酶活的测定

淀粉酶酶活的测定参考Bernfeld[13]的方法并结合自己的标准曲线体系：取190 μL 1%(W/V)的可溶性淀粉为底物，加入到1.5 mL的Eppendorf管中，加入稀释一定倍数的纯酶液10 μL，而空白对照组中加入相同体积的经煮沸灭活的稀释纯酶液，在最适条件下反应10 min，反应结束后加入400 μL的3，5-二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应。沸水浴5 min显色，再迅速置于冰水混合液中快速冷却，混匀后取200 μL混合液于96孔板中，测定其吸光值OD540。酶活力单位定义为在最适条件下，按照上述的反应体系，每1 min生成1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。根据国际酶学会的规定计算比活力，即比活力=酶活(U)/蛋白含量(mg)，重组酶蛋白含量按照《蛋白质技术手册》中的Bradford方法[14]来测定。

1.2.5突变酶的酶学性质研究

(1)最适pH值

取稀释一定倍数的纯酶液10 μL加入到含1%(W/V)可溶性淀粉、2 mol/L NaCl(野生型嗜盐淀粉酶K6的最适NaCl浓度)的不同pH值的磷酸-柠檬酸缓冲液中，在37℃恒温水浴锅中反应10 min后测定其酶活，以最高酶活力为1绘制pH值对酶活力的影响曲线。

(2)最适温度

取稀释一定倍数的纯酶液10 μL加入到含1%可溶性淀粉、2 mol/L NaCl的pH值为7.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中,分别在25～65℃水浴条件下反应10 min，然后测定其酶活，以最高酶活力为1绘制温度对酶活力的影响曲线。

(3)最适NaCl浓度

取稀释一定倍数的纯酶液10 μL加入到含1%可溶性淀粉、pH值为7.0、不同NaCl浓度的磷酸-柠檬酸缓冲液中，在50℃恒温水浴锅中反应10 min后测定其酶活，以最高酶活为1绘制NaCl浓度对酶活力的影响曲线。

(4)Ca2+对酶活性的影响

用不同浓度的Ca2+溶液同时处理稀释酶液(在4℃低温条件下处理12 h)，取10 μL经处理的酶液与1%可溶性淀粉在最适条件下反应10 min后测定其酶活,以未经处理的酶液在同等条件下测得的酶活力为1，绘制Ca2+对酶活力影响曲线。

(5)EDTA对酶活力的影响

参照Ca2+对酶稳定性影响的测定方法，绘制EDTA对酶活力影响的柱状图。

(6)金属离子对酶活力的影响

将终浓度为5 mmol/L的不同金属离子分别与1%可溶性淀粉混匀，取10 μL稀释后的纯酶液分别与上述混合物作用，在最适条件下反应10 min后测定其残余酶活；以未加金属离子的底物为空白对照组，在同等条件下测得的酶活力为1，绘制金属离子对突变酶活力影响的柱状图。

(7)有机溶剂对酶活力的影响

将终浓度为5%(V/V)的不同有机溶剂分别与1%可溶性淀粉混匀，取10 μL稀释一定倍数的纯酶液，在最适条件下反应10 min后测定其酶活，以未加有机溶剂的为空白对照，在同等条件下测得的酶活力为1，绘制有机溶剂对酶活力影响柱状图。

(8)pH稳定性

用不同pH值缓冲液稀释纯酶液(pH值为5～8的磷酸-柠檬酸缓冲液)，于4℃处理12 h，在最适条件下与1%可溶性淀粉反应10 min，然后测定其残余酶活，以未经处理的酶液为空白对照，在相同条件下测得的酶活力为1，绘制酶的pH值稳定曲线。

(9)突变酶温度稳定性

在各温度梯度下，将稀释一定倍数的纯酶液恒温处理1 h，再在最适条件下与1%可溶性淀粉反应10 min，然后测试其残留酶活，以未经处理的酶液为空白对照，在相同条件下测得的酶活力为1，绘制酶的温度稳定性曲线。

(10)NaCl对非嗜盐淀粉酶的活力影响

选定非嗜盐的淀粉酶作为对照，对比分析不同浓度的NaCl对其活力的影响。在其最适条件下，以1%可溶性淀粉为底物，反应10 min，测定其残余酶活，以未加NaCl的为空白对照，相同条件测定其酶活，绘制不同浓度的NaCl对非嗜盐淀粉酶的影响曲线。

1.2.6HPLC对重组嗜盐α-淀粉酶水解产物的检测分析

取过量的纯酶与1 mL 2%可溶性淀粉在最适条件下反应12 h，其产物经处理后用HPLC检测，HPLC分析条件如下：色谱柱：Iltima Amino 100A 5u柱(4.6 mm×250 mm)；检测器：Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器；流动相：80%乙腈，20% H2O；流速：1 mL/min；柱温：28℃。

2结果与分析

2.1目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化

点突变后的目的基因在大肠杆菌JM109中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳得到一条相对分子质量(Mr)约为56 kDa的目的条带(泳道3)(图1)，经镍柱纯化得到突变的目的蛋白(泳道4)。结果表明目的基因在大肠杆菌JM109中成功表达，而且经镍柱纯化后的目的蛋白条带单一，可以进行酶学性质的研究分析。

1：蛋白Marker；2：诱导空载体pSE380/JM109可溶性蛋白；3：诱导转化子pSE380-K6-P368G/JM109可溶性蛋白；

4：纯化的目的蛋白K6-P368G

1:Protein marker;2:Protein from soluble fractions of pSE380/JM109 with induction;3:Protein from soluble fractions of pSE380-K6-P368G/JM109 with induction;4:Purified K6-P368G from soluble fractions of pSE380-K6-P368G/JM109

图1嗜盐淀粉酶的SDS-PAGE

Fig.1SDS-PAGE of the halophilic amylase

2.2酶学性质分析

2.2.1最适pH值

如图2所示，突变酶与野生酶的最适pH值均为7.0；在pH值 6.0以下，两者的相对酶活力几乎为零；在pH值8.0以上，两者的相对酶活力仅为最高酶活力的40%左右。在同等条件下，突变酶具有更高的相对活力，使其在单位酶量下具有更高的生物催化能力。

图2酶的最适pH值

Fig.2Optimal pH of enzymes

2.2.2最适温度

如图3，野生酶的最适温度是55℃，而突变酶的最适温度是50℃，略低于野生酶的最适温度，但是两者非常靠近。温度在40～60℃时，野生酶与突变酶的酶活较高，相对活力维持在70%以上。当温度超过55℃后酶活力急剧下降，可知高温对该酶的抑制作用远大于低温的影响。

图3酶的最适温度

Fig.3Optimal temperature of enzymes

2.2.3最适NaCl浓度

由图4可知，野生酶的的最适NaCl浓度为2 mol/L，而突变酶的最适NaCl浓度为3 mol/L，最适NaCl浓度提高50%，使突变酶在更苛刻的反应条件下依然具有较高的生物催化能力，并且在NaCl浓度达到饱和状态时，其相对活力仍接近50%。

2.2.4Ca2+对突变酶活性的影响

如图5所示，Ca2+浓度对突变酶的活性影响不大，残留的相对酶活力均保持在80%以上。

图4　酶的最适NaCl浓度

图5Ca2+对酶活力的影响

Fig.5Effect of Ca2+on enzyme acivity

2.2.5EDTA对突变酶活性的影响

图6结果表明，EDTA的浓度对突变酶活性的影响不大，残留的相对酶活力均超过85%，且各浓度之间的差异性很小。

图6EDTA对酶活力的影响

Fig.6Effect of EDTA on enzyme activity

2.2.6金属离子对突变酶活性的影响

由图7可见,Cu2+的抑制现象最为明显，几乎完全抑制了突变酶的酶活力。Mg2+、Ca2+和Ba2+的抑制作用最为微弱，残留的相对酶活力均超过80%。Zn2+和Mn2+的影响近似一致，其抑制率约为60%。

2.2.7有机溶剂对突变酶活性的影响

如图8所示，正丙醇、异丙醇、正丁醇、吡啶和四氢呋喃对酶的抑制作用最为明显，酶的相对酶活力损失均超过70%，而乙二醇、乙酸乙酯、1,2-丙二醇、丙三醇及二甲基亚砜的影响基本一致，其抑制率为30%左右。

图7　金属离子对酶活力的影响

图8有机溶剂对酶活力的影响

Fig.8Effect of organic solvents on enzyme activity

2.2.8突变酶的pH稳定性

如图9所示，该酶在pH值为5.0～8.0环境中比较稳定，相对活力均保持在70%以上，证明突变酶的pH稳定性良好，该性质对酶的储存保藏及其在生产生活中的应用等都有积极作用。

图9酶的pH稳定性

Fig.9pH stability of enzyme

2.2.9突变酶的温度稳定性

该酶在40℃以下时，具有较好的热稳定性，其相对酶活力残留达70%以上；超过45℃后，热稳定性急速降低，50℃恒温处理1 h后突变酶的生化催化能力几乎完全丧失(图10)。

图10酶的热稳定性

Fig.10Thermal stability of enzyme

2.2.10NaCl对非嗜盐α-淀粉酶的活性的影响

从图11可以看出，超过一定浓度的NaCl对非嗜盐α-淀粉酶具有明显抑制作用，而对嗜盐α-淀粉酶就没有相似的作用(图4)，说明不是所有的蛋白酶都需要高浓度的氯化钠。

图11NaCl对非嗜盐淀粉酶活力影响

Fig.11Effect of NaCl on nonhalophilic enzyme activity

2.2.11HPLC对突变酶水解产物的检测分析

检测结果表明(图12)，该酶水解可溶性淀粉后的产物以葡萄糖为主，并含有少量的麦芽糖和麦芽三糖。

图12酶水解淀粉产物HPLC分析色谱图

Fig.12HPLC chromatogram of the products from starch by enzyme

3讨论

嗜盐α-淀粉酶能在极端环境下维持空间结构的稳定和生物催化活性，因而在食品腌制、发酵、调味剂的生产，海洋食品的开发，烘焙等多行业具有广阔的应用前景。本实验组另辟蹊径，从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆扩增到一个嗜盐α-淀粉酶基因并成功表达，并非从传统途径嗜极菌Halorhabdus utahensis[15]、Haloacrula hispanica[16]、Pseudoal-

teromonsa sp.strain CP76[17]等中获得嗜盐α-淀粉酶基因,这为扩展嗜盐α-淀粉酶的来源，寻找适合人类需求的生物催化酶类提供多种选择途径。通过定点突变，本实验所研究的嗜盐淀粉酶的酶学特性相对于野生型发生明显变化，尤其是其嗜盐程度，最适NaCl浓度由野生酶的2 mol/L提高到3 mol/L,其比活力也增加近4倍，达到4 831 U/mg，这为该酶的分子改造打下坚实的基础，也为进一步研究探索其嗜盐机理提供新的信息和依据。

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(责任编辑：米慧芝)

Escherichia coli Halophilic alpha Amylase Gene Molecular Modification and Enzymology Characteristics

李剑龙1,2，杨媛1,2，吴昊1,2，汤宏赤1,2，韦宇拓1,2**

LI Jianlong1,2，YANG Yuan1,2，WU Hao1,2，TANG Hongchi1,2，WEI Yutuo1,2

(1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530005)

(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China;2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Nanning,Guangxi,530005,China)

摘要：【目的】对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造，并探索嗜盐α-淀粉酶的嗜盐特性。【方法】从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达。通过同源建模，确定Na+结合位点上的氨基酸残基，并对相应位点进行定点突变。最后对突变酶的酶学性质进行研究。【结果】相对于野生酶，突变酶更加嗜盐，其最适NaCl浓度由2 mol/L增加到3 mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃，酶活力为4 831 U/mg,提高近4倍。经HPLC检测，突变酶与2%(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。【结论】嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系。

关键词：非嗜盐菌嗜盐淀粉酶同源建模定点突变

Abstract：【Objective】The modification of halophilic α-amylase gene -was conducted in Escherichia coli to explore halophilic properties of halophilic α-amylase.【Methods】Firstly, a halophilic amylase gene was cloned from the non-halophilic bacteria E.coli JM109, and the recombinant gene was successfully expressed.Secondly,the amino acid binding site of Na+ was determined by homology modeling, and site-directed mutagenesis was conducted at the corresponding sites.Finally,the enzymatic properties of the mutant enzymes were studied.【Results】The mutant enzyme was characterized by higher halophilic property than wild type,and the optimum concentration of NaCl increased from 2 mol/L added to 3 mol/L. The halophilic amylase had the optimum pH at 7 and the optimum temperature at 50℃,under which its specific activity was 4 831 U/mg,revealing nearly fourfold increase than the original enzyme.HPLC testing showed that the products were mixed with glucose，maltose and maltotriose after the reaction with 2%(W/V) of soluble starch.【Conclusion】Halophilic characteristics of halophilic amylase gene k6 has direct relationship with Na+ binding site.

Key words：non-halophilic bacteria，halophilic amylase，homology modeling，site-directed mutagenesis

中图分类号：Q93

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0025-06

作者简介：李剑龙(1988-)，男，硕士研究生，主要从事微生物生物技术研究。

收稿日期：2015-11-20

修回日期：2016-01-31

*国家自然基金项目(31460437)和广西研究生教育创新计划项目(YCSZ2014050)资助。

**通讯作者：韦宇拓(1971-)，男，教授，主要从事发酵与酶工程研究,E-mail:weiyutuo@gxu.edu.cn。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):25～30

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.010.html