卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立*



卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立*

0引言

【研究意义】随着水产养殖业的快速发展,链球菌(Streptococcus)导致的疾病频繁暴发,并在世界范围内造成重大经济损失。迄今为止，链球菌病的主要致病菌包括副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)、Lactococcus piscium、鲑鱼漫游球菌(Vagococcus salmoninarum)、栖鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)[1-4]。1957年日本在养殖虹鳟鱼(Oncorhychus mikiss)上发现链球菌病，这是最早发现的鱼类链球菌感染性疾病[5]。20世纪80年代以后，已有多个国家报道了鱼类链球菌病的暴发与流行，包括尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica(linnaeus))、 尼罗尖吻鲈(Lates niloticus)、大菱鲆(Psetta maxima)、卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)、黄狮鱼(Seriola quinqueradiata)、红鼓鱼(Sciaenops ocellatus)、海鲷(Sparus auratus)、日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)[6-15]。而在中国，养殖罗非鱼(Oreochromis speices)的链球菌发病率为20%～50%，死亡率为50%～70%，甚至更高,链球菌病已严重危害中国罗非鱼养殖业的健康发展[16]。近年来，卵形鲳鲹凭借其肉质具有鲹类特殊鲜味、生长速度快、出口加工市场前景诱人等特点，养殖规模一度呈倍数增长态势[17-18]。然而由于卵形鲳鲹主要养殖模式是采用高密度的近海网箱养殖，随着该养殖产业的快速发展和无序扩张，海区负荷过大，养殖环境不断恶化，导致卵形鲳鲹细菌性病害暴发日益频繁。【前人研究进展】2007年，周素明等[19]首次从卵形鲳鲹上分离到停乳链球菌，随后在2014年，黄婷等[20]从患病的卵形鲳鲹上同时分离到无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌。本实验室于2012-2014年针对卵形鲳鲹进行流行病学调查，陆续从北海、湛江、深圳、珠海等地分离到无乳链球菌、停乳链球菌、格式乳球菌和海豚链球菌，发现链球菌的分离频率不断增加，这表明链球菌病已成为威胁卵形鲳鲹健康养殖的主要病原之一。【本研究切入点】目前采用的生化反应、药敏试验和电镜观察等传统的诊断方法耗时费力，因此有必要开发一种经济有效的,能快速检测出卵形鲳鲹感染链球菌情况的诊断技术。【拟解决的关键问题】建立一个多重PCR体系，旨在快速、准确地检测无乳链球菌、停乳链球菌、海豚链球菌和格式乳球菌4种主要的致病菌，为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。

1材料与方法

1.1材料

实验用阳性对照的4种菌株(表1)：停乳链球菌和格式乳球菌由中国水产科学研究院南海水产研究所徐力文副研究员惠赠。无乳链球菌和海豚链球菌为本实验室-20℃保存。

表1实验用的4种参考菌株信息表

Table 1Information of reference strains used in the experiment

细菌Microorganism菌株Strain宿主Host采样地点Geographicorigin停乳链球菌S.dysgalactiaeTS01卵形鲳鲹T.ovatus深圳Shenzhen无乳链球菌S.agalactiaeTS02卵形鲳鲹T.ovatus北海Beihai海豚链球菌S.iniaeTS04卵形鲳鲹T.ovatus北海Beihai格式乳球菌L.garvieaeTS03海鲈Lateolabraxja-ponicas珠海Zhuhai

病原菌菌株(表2)：2014年6～8月在北海和湛江两地采集临床症状有食欲不振、昏睡、眼球突出、眼角膜混浊等的患病卵形鲳鲹11份,无菌条件下，分别取患病卵形鲳鲹的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织接种于血平板上，于30℃下恒温培养24～48 h，挑取优势单菌落在血平板上再次划线分离纯化。

表2自然发病卵形鲳鲹的病原菌菌株信息表

Table 2Bacterial strains from natural infected golden pompano were detected by m-PCR

菌株Strain组织Tissue采样日期Date采样地点GeographicoriginTS07脑Brain20140615北海BeihaiTS08肝脏Liver20140615北海BeihaiTS09脑Brain20140718湛江ZhanjiangTS10肾脏Kidney20140718湛江ZhanjiangTS11脾脏Spleen20140718湛江ZhanjiangTS12肝脏Liver20140718湛江ZhanjiangTS13脾脏Spleen20140728湛江ZhanjiangTS14肝脏Liver20140728湛江ZhanjiangTS15脾脏Spleen20140828北海BeihaiTS16肝脏Liver20140828北海BeihaiTS17肾脏Kidney20140828北海Beihai

试剂：DNA提取试剂盒MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit、PCR试剂(10×PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、Taq DNA聚合酶)购自大连宝生物工程有限公司;4K DNA Marker 购自北京全式金生物技术有限公司。

BHI培养基：1 000 mL水中加入24.5 g脑心浸出液肉汤、10 g酵母粉、2 g葡萄糖，固体培养基加15 g 琼脂，121℃高压灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1细菌基因组DNA的提取

将实验菌株接入BHI液体培养基中，于33℃恒温摇床220 r/min振荡培养24～48 h后,按照MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa,Japan)说明书提取细菌基因组DNA，提取后保存至-20℃备用。

1.2.2引物的设计和合成

依据无乳链球菌的特异性基因cfb的序列，停乳链球菌的特异性基因tuf的序列，海豚链球菌和格式乳球菌的16S rRNA序列设计4对引物(表3)，由广州英潍捷基有限公司合成。

1.2.3多重PCR反应体系的建立

25 μL反应混和液内含1.0 μL模板DNA,1.5 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTPs,1 U TaqDNA 聚合酶,2.5 μL 10×PCR缓冲液。多重PCR反应条件：94°C 预变性5 min;94°C变性35 s,55°C 退火40 s,72°C延伸45 s，32个循环;72°C延伸10 min。PCR扩增产物在1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳,溴化乙锭染色,紫外线下观察、拍照。用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化目的PCR扩增产物，由广州英潍捷基有限公司完成测序。

1.2.4多重PCR条件的优化

通过调整4对引物之间的比例以及退火温度的梯度变化(48.0℃、49.3℃、51.8℃、54.3℃、57.0℃、58.6℃)，从中优化出最适条件。

1.2.5多重PCR灵敏性检测

将提取备用的4种检测菌株的基因组DNA分别稀释为8×10-1ng/μL、 4×10-1ng/μL、 2×10-1ng/μL、1×10-1ng/μL、5×10-2ng/μL，按照已优化的多重PCR反应条件进行PCR扩增，测定其灵敏性。

表3多重PCR引物序列以及预期扩增片断大小

Table 3Primer sequences used for PCR amplification and the expected amplicon size

引物Primerparis序列(5'3')Sequences(5'3')目的基因Targetgene变性温度Annealingtemperature(℃)片段大小PCRamplicon(bp)菌种Pathogen参考文献ReferencescfbFcfbRAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTCAGTAATCAAGCCCAGCAAcfb51470无乳链球菌S.agalactiae[21]tufFtufRGTAGTTGCTTCAACAGACGGGGCGATTGGGTGGATCAACTCtuf51795停乳链球菌S.dysgalactiae[22]PLGFPLGRCATAACAATGAGAATCGCGCACCCTCGCGGGTTG16SrRNA501100格式乳球菌L.garvieae[23]SiFSiRCACTAATCCAAAGAGTTTTAGGCGGCTGGCTCCTAA16SrRNA501391海豚链球菌S.iniae[24]

1.2.6多重PCR对临床样品的检测

将从自然发病的卵形鲳鲹中分离纯化到的病原菌接种于BHI液体培养基中，扩大培养后提取病原菌基因组DNA后，利用优化的多重PCR体系检测。为验证多重PCR的结果，用通用引物27 F (5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′)和1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因。PCR产物测序由广州英潍捷基有限公司完成，将所得序列在Genebank 中进行比对分析。

2结果与分析

2.1多重PCR条件的优化

对比测试4对引物之间的比例，结果显示当多重PCR的反应体系中分别加入0.2 μmol/L引物cfb-F/cfb-R，0.08 μmol/L引物tuf-F/tuf-R，1.6 μmol/L引物Si-F/Si-R和0.4 μmol/L引物PLG-F/PLG-R，即比例为1∶0.4∶8∶2时，4条PCR产物能同时扩出来。如图1所示，退火温度为54.3℃时各条带亮度均匀，没有非特异条带产生，说明54.3℃为最佳退火温度。

1和7：4K DNA Marker;2：阴性对照;3：S.iniae TS04;4：L.garvieae TS03;5：S.parauberis TS01;6：S.agalactiae TS02;8～13：退火温度依次为48℃、49.3℃、 51.8℃、54.3℃、57℃、58.6℃

1 and 7:4K DNA Marker;2:negative control;3:S.iniae TS04;4:L.garvieae TS03;5:S.parauberis TS01;6:S.agalactiae TS02;8 to 13:the optimization of annealing temperature at 48℃,49.3℃,51.8℃,54.3℃,57℃ and 58.6℃,respectively

图1多重PCR对单种细菌的扩增以及最适退火温度

Fig.1Specificity of the m-PCR assay for the detection of S.iniae (1 391 bp), L.garvieae (1 100 bp),S.parauberis (795 bp) and S.agalactiae (470 bp),and the optimization of annealing temperature

2.2多重PCR灵敏度检测

对多重PCR反应体系进行灵敏度检测，结果显示最低检测浓度为5×10-2ng/μL(图2)。

1：4K DNA Marker;2：0.8 ng/μL;3：0.4 ng/μL;4：0.2 ng/μL;5：0.1 ng/μL;6：0.05 ng/μL

图2多重PCR灵敏度检测

Fig.2Sensitivity of the m-PCR assay

2.3临床样品多重PCR的检测结果

如图3所示，多重PCR成功扩增出海豚链球菌的特异条带1 391 bp 2条，无乳链球菌的特异条带470 bp 4条，其余5份样品未见目的条带。所有菌株的16S rRNA基因PCR产物经测序、比对相似性分析表明，分离菌株TS07、TS08与已报道的海豚链球菌(NCBI序列号：KC748467)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS09、TS10、TS11、TS13与已报道的无乳链球菌(NCBI序列号：JQ039375)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS12、TS14与已报道的气囊水栖菌Enhydrobacter aerosaccus(NCBI序列号：KF013200)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS15、TS16与已报道的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus(NCBI序列号：CP006008),TS17与已报道的创伤弧菌Vibrio vulnificus(NCBI序列号：CP009261)16S rRNA 基因序列相似性为100%。

1，13：4K DNA Marker;2：TS07；3：TS08；4:TS09；

5：TS10；6：TS11；7：TS12；8：TS13；9：TS14；10：TS15；11：TS16；12：TS17

图3自然发病卵形鲳鲹病原样品的多重PCR检测

Fig.3Detection of bacterial from naturally infected T.ovatus samples by m-PCR

3讨论

由于传统鉴定致病菌的生化反应、药敏试验和电镜观察等诊断方法耗时、费力，建立一个快速、经济、灵敏的诊断技术能有效得防止疾病的暴发。Henegariu等[25]认为多重PCR体系构建成功的关键在于各引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、氯化物和dNTPs之间的平衡以及循环的温度。多数学者[26-28]则认为多重PCR体系的优化主要为改变退火温度、MgCl2、dNTPs和聚合酶的浓度等。Panangala等[29]建立多重PCR时通过调整引物之间的浓度，其中最高浓度引物是最低浓度引物的1.5倍。本研究中，通过预试验显示多重PCR体系构建成功关键参数为4对引物之间的比例和退火温度，其中海豚链球菌的特异基因最难扩增。因此，在反应体系中大幅度提高了海豚链球菌引物Si-F/Si-R的浓度，使得引物Si-F/Si-R的浓度是tuf-F/tuf-R的20倍；此外，当退火温度为54.3℃时，可避免目的条带不均匀扩增，非特异性条带的出现，确定54.3℃为最佳退火温度。

3对引物cfb-F/cfb-R,PLG-F/PLG-R,Si-F/Si-R的特异性在之前的文献中都用系统进化相关菌进行过验证[21，24，30]，均未扩增出相关条带，而tuf基因能够区分分类关系上即使是最相近的链球菌种[22]，所以本研究并没有对该多重PCR体系进行特异性验证。本实验最低能够检测到5×10-2ng/μL 的基因组DNA模板的质量浓度，这和其他学者的研究结果类似，比如鳗弧菌Vibrio anguillarum的最低检测浓度为50 pg，海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房链球菌、格式乳球菌为12.5～50 pg[30-31]，因此，本实验的灵敏度能够达到对链球菌病诊断的需求。

另外，为了验证多重PCR的可靠性，本实验用通用引物扩增其16S rRNA基因，产物测序后经过比对证明。值得注意的是，结果显示同一条鱼上的不同组织可能感染不同的细菌，这与黄婷等[20]报道从发病卵形鲳鲹上首次同时分离到无乳链球菌和海豚链球菌的结果一致，但是传统观念认为一条鱼只能感染一种细菌，这可能与不同组织的感染途径不同有关，有待于进一步进行深入研究。

4结论

初步建立的多重PCR反应体系中引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2 μmol/L、0.08 μmol/L、1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最优退火温度为54.3℃，能同时检测无乳链球菌、停乳链球菌、海豚链球菌和格式乳球菌4种主要的卵形鲳鲹致病链球菌，为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。

致谢

感谢中国水产科学研究院南海水产研究所徐力文副研究员惠赠无乳链球菌和停乳链球菌。

参考文献:

[1]BERCOVIER H,GHITTINO C,ELDAR A.Immunization with bacterial antigens:Infections with Streptococci and related organisms[J].Dev Biol Stand,1997,90:153-160.

[2]ELDAR A,HOROVITCZ A,BERCOVIER H.Development and efficacy of a vaccine against Streptococcus iniae infection in farmed rainbow trout[J].Vet Immunol Immunopathol,1997,56:175-183.

[3]ELDAR A,GORIA M,GHITTINO C,et al.Biodiversity of Lactococcus garvieae strains isolated from fish in Europe,Asia,and Australia[J].Appl Environ Microbiol,1999,65:1005-1008.

[4]ELDAR A,GHITTINO C.Lactococcus garvieae and

Streptococcus iniae infections in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss:Similar but different diseases[J].Dis Aquat Org,1999,36:227-231.

[5]HOSHINA T,SANO T,MORIMOTO Y.A Streptoco-

ccus pathogenie to fish[J].J Tokyo Univ Fish,1958,44:57-58.

[6]AHMED H A.First isolation of Streptococcus sp.from hybrid tilapia (Oreochromis niloticus×O.aureus) in Saudi Arabia[J].Aquaculture,1994,128(3-4):195-201.

[7]PERERA R P,JOHNSON S K,COLLINS M D,et al.Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica×T.aurea Hybrids[J].J Aquat Anim Health,1994,6:335-340.

[8]SHOEMAKER C A,EVANS J J,KLESIUS P H.Density and dose:Factors affecting mortality of Streptococ-

cus iniae infected tilapia (Oreochromis niloticus)[J].Aquaculture,2000,188:229-235.

[10]BROMAGE E S,THOMAS A,OWENS L.Streptoc-

occus iniae,a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer[J].Dis Aquat Org,1999,36:177-181.

[11]AMAL M N A,ZAMRI-SAAD M，IFTIKHAR A R,et al.An outbreak of Streptococcus agalactiae infection in cage-cultured golden pompano,Trachinotus blochii (Lacépède),in Malaysia[J].J Fish Dis,2012,35(11):849-852.

[12]MATSUYAMA H,MANGINDAAN R E P,YANO

T.Protective effect of schizophyllan and scleroglucan against Streptococcus sp.infection in yellowtail (Seriola quinqueradiata)[J].Aquaculture,1992, 101:197-203.

[13]ELDAR A,PERL S,FRELIER P F,et al.Red drum,Sciaenops ocellatus mortalities associated with Streptococcus iniae infection[J].Dis Aquat Org,1999,36:121-127.

[14]NGUYEN H T,KANAI K,YOSHIKOSHI K.Ecological investigation of Streptococcus iniae in cultured Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) using selective isolation procedures[J].Aquaculture,2002,205:7-17.

[15]EVANS J J,KLESIUS P H,GILBERT P M,et al.

Characterization of haemolytic group B Streptococcus agalactiae in cultured seabream,Sparus auratus L.,and wild mullet,Liza klunzingeri (Day),in Kuwait[J].J Fish Dis,2002,25:505-513.

[16]卢迈新.罗非鱼链球菌病研究进展[J].南方水产,2010,6 (1):75-79.

LU M X.Review of research on streptococcosis in Tilapia[J].South China Fisheries Science,2010,6(1):75-79.

[17]陈伟洲,许鼎盛,王德强,等.卵形鲳鲹人工繁殖及育苗技术研究[J].台湾海峡,2007,26(3):435-442.

CHEN W Z,XU D S,WANG D Q,et al.Study on the spawning and hatching technique for Trachinotus ovatus[J].J Oceanogr Taiwan Strait,2007,26(3):435-442.

[18]杨火盛.卵形鲳鲹人工养殖试验[J].福建水产，2006，1:39-41.

YANG H S.Studies on the culture of pompano,Trachinotus ovatus[J].J Fujian Fish,2006,1:39-41.

[19]周素明,李安兴,马跃,等.养殖鱼类链球菌病原的分离鉴定及其16S rDNA分析[J].中山大学学报:自然科学版,2007,46(2):68-71.

ZHOU S M,LI A X,MA Y,et al.Isolation,identification and characteristics of 16S rDNA gene sequences of the pathogens responsible for the streptococcicisis in cultured fish[J].Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2007,46(2):68-71.

[20]黄婷,李莉萍,王瑞,等.卵形鲳鲹感染无乳链球菌与海豚链球菌的研究[J].大连海洋大学学报,2014,2:161-166.

HUANG T，LI L P，WANG R，et al.Pathogenic bacteria Streptococcus agalactiae and S.iniae in diseased ovate pompano Trachinotus ovatus [J].Journal of Dalian Ocean University,2014,2:161-166.

[21]黎炯,叶星,卢迈新,等.双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌[J].湖南农业大学学报,2010,36 (4):449-452.

LI J,YE X,LU M X,et al.Rapid identification of Streptococus agalactiae and Streptococus iniae with duplex PCR assay[J].Journal of Hunan Agricultural University,2010,36 (4):449-452.

[22]ABDELSALAM M,EISSA A E,CHEN S C.Genetic diversity of geographically distinct Streptococcus dysgalactiae isolates from fish[J].Journal of Advanced Research,2015,6 (2):233-238.

[23]ZLOTKIN A,ELDAR A,GHITTINO C,et al.Identification of Lactococcus garvieae by PCR[J].J Clin Microbiol，1998，36:983-985.

[24]CHIN I C,CHIA C W,TA C C,et al.Multiplex neste-dpolymera chain reaction for the simultaneous detection of Aeromonas hydrophila,Edwardsiella tarda,Photobacterium damselae and Streptococcus iniae,four important fish pathogens in subtropical Asia[J].Aquac Res,2009,40:1182-1190.

[25]HENEGARIU O,HEEREMA N A,DLOUHY S R,et al.Multiplex PCR:Critical parameters and step-by-step protocol[J].BioTechnique,1997,23:504-511.

[26]CERRO A,MARQUEZ I，GUIJARRO J A.Simultaneous detection of Aeromomas salmonicida,Flavobacte-

rium psychrophilum,and Yersinia ruckeri,three major fish pathogens,by multiplex PCR[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(10):5177-5180.

[27]ILHAN A,EROL C,SEVKI K.Development of multiplex PCR assay for simultaneous detection of five bacterial fish pathogens[J].Vet Microbiol,2008,131:332-338.

[28]ILHAN A.Multiplex PCR assay for detection of four major bacterial pathogens causing rainbow trout disease[J].Dis Aquat Org,2011,93:199-206.

[29]VICTOR S P,CRAIG A S,VICKY L S,et al.Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogens,Flavobacterium columnare,Edwardsiella ictaluri,and Aeromonas hydrophila[J].Dis Aquat Org,2007,74:199-208.

[30]MATA A I,GIBELLO A,CASAMAYOR A,et al.

Multiplex PCR assay for detection of bacterial pathogens associated with warm-water streptococcosis in fish[J].Appl Environ Microbiol,2004b,70:3183-3187.

(责任编辑：竺利波)

Development of Multiplex PCR Assay for Detection of Main Streptococcosis Pathogens in Trachinoms ovatus

熊向英，蔡小辉，彭银辉，黄国强，梁志辉，王志成**

XIONG Xiangying,CAI Xiaohui,PENG Yinhui,HUANG Guoqiang，LIANG Zhihui,WANG Zhicheng

(广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000)

(Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Guangxi Institute of Oceanology,Beihai,Guangxi,536000,China)

摘要：【目的】快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4种主要的致病菌，为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。【方法】针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R，建立多重PCR反应体系，通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度，对反应体系进行优化及灵敏度测试。2014年6～8月，应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测，然后用通用引物扩增16S rRNA基因，经测序、比对检测体系的准确性。【结果】反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2 μmol/L，0.08 μmol/L，1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10(-2) ng/μL；11份病原样品检测中，2份出现海豚链球菌的目的条带，4份出现无乳链球菌的目的条带，5份未见目的条带，和测序分析结果一致。【结论】多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌。

关键词：多重PCR链球菌病无乳链球菌停乳链球菌格式乳球菌海豚链球菌

Abstract：【Objective】A method with multiplex PCR was developed for rapid and accurate detection of the four main streptococcosis pathogens of Streptococcus agalactiae,Streptococcus dysgalactiae,Streptococcus iniae,and Lactococcus garvieae isolated from golden pompano Trachinotus ovatus,in order to provide theoretical foundation for healthy aquaculture of Trachinotus ovatus.【Methods】Each of the four pairs of oligonucleotide primers including cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R exclusively amplified the target gene of the specific microorganism.The multiplex PCR was optimized by testing the proportion between the four sets of primers and the annealing temperature.And the sensitivity of the multiplex PCR assay was evaluated using pure DNA.A total of 11 pathogen samples were collected from cultured Trachinotus ovatus from June to August in 2014,and analyzed using the established multiplex PCR to test its applicability.To verify the results of the multiplex PCR,molecular identification was performed by amplification of 16S rRNA gene with universal primers.【Results】The optimized relative concentrations of the primers were 0.2 μmol/L each of cfb-F/cfb-R,0.08 μmol/L each of tuf-F/tuf-R,1.6 μmol/L each of Si-F/Si-R and 0.4 μmol/L each of PLG-F/PLG-R.The sensitivity of the multiplex PCR using purified DNA was 5×10(-2)ng/μL.The application results revealed that 2 of the pathogen samples were S.iniae,4 samples were S.agalactiae and no products were amplified from the other 5 pathogen samples.Sequencing of 16S rRNA and BLAST analysis were consistent with the results of the multiplex PCR.【Conclusion】The above results indicated that the multiplex PCR is a sensitive,specific and reproducible assay method for the simultaneous detection of four pathogenic bacteria that cause disease in golden pompano.Therefore,it could be a useful alternative to the conventional method for microbial detection.

Key words:multiplex PCR,Streptococcosis,Streptococcus agalactiae,Streptococcus dysgalactiae,Streptococcus iniae,Lactococcus garvieae

中图分类号：S941

文章标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0035-06

作者简介：熊向英(1984-)，女，助理研究员，主要从事水产动物病原生物学研究。

收稿日期：2015-06-15

修回日期：2015-08-05

*广西面上基金项目(2012GXNSFAA053065)，广西科技攻关项目(桂科攻1222013-2)，广西区直属公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(GXIF-2012-02)和国家海洋局项目(201205028-4)资助。

**通讯作者：王志成(1962-)，男，副研究员，主要从事海水养殖研究,E-mail:WZC66666@126.com。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):35～40

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1515.028.html