纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定*



纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定*

0引言

【研究意义】海藻糖旧称茧蜜糖和覃糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、植物和无脊椎动物当中[1-2]。海藻糖在许多生物中起到维持渗透压、保护体内蛋白质、核酸及生物膜的作用[3-5]，对在高温、干燥、冷冻、高渗甚至是辐射等极端条件下维持生命的存在起到关键作用，所以被称为“生命之糖”[1]。海藻糖的优异特性使得它在食品、化妆品、医药、保健品等诸多行业得到广泛应用[6-9]，随着海藻糖研究的推进，海藻糖将具有更为广阔的应用前景。【前人研究进展】海藻糖合成酶可以将麦芽糖通过一步转化作用生成海藻糖，用其制备海藻糖较其他方法具有原料低廉、转化率较高等诸多优势[10-11]。自从在1995年被日本的Nishimoto等[12-13]首次在Pimelobacter sp.R48中发现，海藻糖合成酶便成为世界各国科学家积极深入研究的对象。现已从多种生物中克隆到海藻糖合成酶基因，其中大部分来自细菌[14]。【本研究切入点】多数海藻糖合成酶最适反应温度偏低，应用到工业生产中会造成生产耗能过大、设备利用率较低等问题，若在偏离生物酶最适作用条件下反应则会造成酶活性降低甚至是失活。【拟解决的关键问题】克隆纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS)，构建重组质粒转入大肠杆菌中表达及纯化，并对重组酶进行酶学性质研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

纤维微菌(Cellulosimicrobium cellulans)、克隆宿主Escherichia coli Trans10、表达宿主Escherichia coli BL-21(DE3)及表达载体pSE380均由本实验室保藏，pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2酶和主要试剂

DNA聚合酶、限制性内切酶等分子生物学工具酶购自宝生物工程(大连)有限公司和东洋纺(上海)生物科技有限公司；IPTG购自Gibco公司；镍离子金属螯合亲和层析介质购自Phamacia公司；果糖、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖均为色谱纯Sigama公司产品；乙腈购自Fisher公司；其它试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1CCTreS保守区的扩增

在Genbank数据库中检索到纤维微菌属的Cellulosimicrobium cellulans J36和Cellulosimicrobium cellulans LMG 16121等几种菌的假定的海藻糖合成酶基因，将其与其它几种海藻糖合成酶基因进行blast分析，根据比对结果设计引物P1：5′-GCACCGCTTCTTCTCCCACC-3′；P2：5′-CGACGCACAGGATCGTCTCC-3′，以纤维微菌总DNA为模板扩增海藻糖合成酶基因保守区。PCR体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 4 μL，引物P1(10 μmol/L) 1 μL，引物P2(10 μmol/L) 1 μL，纤维微菌总DNA(100 ng/μL) 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 补至50 μL。PCR程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物送测序。

1.2.2反向PCR扩增保守区外未知区域

(1) 酶切处理纤维微菌总DNA

根据Genbank数据库中Cellulosimicrobium cellulans J36的全基因测序结果，查找到位于海藻糖合成酶基因3′端下游位置的KpnⅠ酶切位点，KpnⅠ完全酶切后包含有保守区的目的片段大小约为2 kb。采用KpnⅠ对纤维微菌总DNA进行充分酶切，37℃下反应36 h(中间补加两次酶)，尽量酶切充分。

(2)连接

将酶切纯化后的DNA用T4连接酶在16℃条件下连接过夜。

(3) 反向PCR

根据保守区测序结果，分别在扩增到的保守区核苷酸序列212，826，114，864位点设计两对反向引物：上游P3：5′-CGGCCACTGGTTCGCCTCGGCG-3′；下游P4:5′-GACGTCGCTGCTGCACTGGGTG-3′；上游P5：5′-TCTCGCAGTTGGTGCCCTCGGC-3′；下游P6：5′-CCGCTCGACTGCGACAACCAGT-3′。以(2)中连接产物为模板，用引物P3、P4进行第一次PCR，回收第一次PCR产物做模板，以引物P5、P6进行第二次PCR，第二次PCR目的是为了验证第一次PCR是否扩增到含有未知区域的DNA片段(图1)。PCR体系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 4 μL，引物a(10 μmol/L) 1 μL，引物b(10 μmol/L) 1 μL，模板DNA 1 μL，KOD DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL，DMSO 4 μL，甲酰胺 2 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。反向扩增成功后，将PCR产物送测序。

图1反向PCR示意图[15]

Fig.1The process of inverse PCR

1.2.3CCTreS完整ORF的克隆及重组质粒的构建

根据来源于Cellulosimicrobium cellulans J36的海藻糖合成酶基因和1.2.2节的PCR产物测序结果设计CCTreS的上游和下游引物，在上游引物添加酶切位点EcoRⅠ(下划线部分)，并在起始密码子后添加6个组氨酸，即P7：5′-CTGAATTCATGCACCATCATCATCATCATGTGACGTTCCCGCGCG ACGCTGCACCGGTC-3′；在下游引物添加酶切位点HindⅢ(下划线部分)，即 P8：5′-ACAAAGCTTTCACGCGGGGTCGTGCACGAC-

GAGC-3′。以纤维微菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 4 μL，引物P7(10 μmol/L) 1 μL，引物P8(10 μmol/L) 1 μL，纤维微菌总DNA(100 ng/μL) 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 补至50 μL。程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳验证后胶回收纯化，产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pSE380连接，连接产物转化至大肠杆菌Trans10感受态细胞，筛选重组质粒pSE380-CCTreS并送测序。

1.2.4重组蛋白表达与纯化

将重组质粒pSE380-CCTreS转入大肠杆菌BL-21(DE3)，37℃培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，20℃诱导培养20 h后离心收集菌体。用10 mL Lysis Buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH值为8.0)重悬，超声波破碎细胞，破碎条件：工作功率200 W，工作时间7 s，间歇时间10 s，总共时间20 min，4℃。破碎完成后，4℃条件下充分离心，收集上清液即为粗酶液，将粗酶液利用镍柱亲和层法进行纯化。采用10% SDS-PAGE检测纯化效果，蛋白质含量检测参照Bradford法[16]。

1.2.5重组蛋白酶活力的测定

稀释适当倍数的纯酶10 μL加入190 μL 2%(W/V)的麦芽糖底物中，在一定温度下反应30 min，反应结束后沸水浴10 min终止反应，去除固体杂质后HPLC检测海藻糖含量。HPLC检测条件：柱温24℃，柱压60 bar，流动相成分为乙腈∶水=79∶21(V/V)，流速1 mL/min。所有实验数据测定均为3个平行实验。酶活力单位(U)：在特定条件下1 min生成1 μmol海藻糖所需要的酶量为一个活力单位。

1.2.6温度和pH值对酶活力的影响

温度的影响：在pH值为7.0的环境下，以浓度2%的麦芽糖为底物，分别在25～60℃(每隔5℃为一个梯度)条件下反应30 min，HPLC测定酶活力，以酶活力最高者为100%，绘制相对酶活力曲线。

pH值的影响：在最适反应温度下，分别在pH值为4.0～9.0(pH值每隔0.5为一个梯度)条件下反应30 min，HPLC测定酶活力，以酶活力最高者为100%，绘制相对酶活力曲线。

1.2.7酶的热稳定性和pH稳定性

热稳定性：将纯酶分别置于25～60℃(每隔5℃为一个梯度)条件中保温1 h，在酶的最适反应温度和pH值下反应30 min，HPLC测定酶活力，以4℃保存的酶在最适条件下的酶活力为对照，计算相对酶活力。

pH稳定性：将酶分别置于pH值为4.0～9.0(pH值每隔0.5为一个梯度)环境中4℃保存24 h，然后在酶的最适反应温度和pH值下反应30 min，HPLC测定酶活力，以未处理的酶做对照，计算每个梯度下的相对酶活力。

1.2.8金属离子和化学试剂对酶活力的影响

在酶反应体系中添加终浓度为5 mmol/L的金属离子Ca2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、K+、Co2+、Cu2+以及5 mmol/L的SDS、DTT和10 mmol/L的EDTA，在酶的最适反应温度和pH值下反应30 min，HPLC测定酶活力，以不含有金属离子和化学试剂的反应作为对照，计算各个条件下的相对酶活力。

1.2.9重组酶水解麦芽糖的产物组成分析

以2%(W/V)的麦芽糖为底物，分别在25℃、35℃、45℃及最适pH值条件下反应48 h，分别于20 min，40 min，1 h，1.5 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，36 h，48 h取样并采用HPLC检测分析产物变化。

1.2.10底物特异性的研究

酶在最适条件下分别与浓度为2%(W/V)的海藻糖、纤维二糖、果糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽三糖、普鲁兰糖、海藻酮糖、山梨糖、糊精、淀粉反应36 h，HPLC检测产物。

2结果与分析

2.1目的基因CCTreS的克隆

成功克隆出目的基因CCTreS的保守区，根据测序结果设计两对反向PCR引物P3和P4、P5和P6。引物P3与引物P5间距为98 bp，引物P4与引物P6间距为38 bp。如图2所示，第一次PCR扩增得到大小约为1.3 kb的条带；第二次PCR扩增获得大小约为1.2 kb的条带。两次PCR的结果相差大小符合两对引物间的距离，表明反向PCR扩增到保守区以外的未知区域获得成功。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1:The inverse PCR product of the first time；2:The inverse PCR product of the secend time；M2:W2003 DNA Marker

图2反向PCR产物凝胶电泳分析

Fig.2Agarose gel eletrophoresis analysis of inverse PCR product

2.2CCTreS完整ORF的克隆及重组质粒的构建

成功扩增到大小约为1.8 kb的CCTreS完整ORF，并用于构建重组质粒pSE380-CCTreS。双酶切验证结果显示出两条带，大小分别为1.8 kb和4.3 kb左右(图3)，这分别与目的基因和pSE380载体大小一致，证明重组质粒构建成功。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1:CCTreS gene；

2:pSE380-CCTreSdigested with EcoRⅠ and HindⅢ；

M2:W2003 DNA Marker

图3pSE380-CCTreS重组质粒的双酶切验证

Fig.3Verification of recombinant plasmid pSE380-CCTreSdigested with EcoRⅠ and HindⅢ

2.3重组酶CCTreS的表达纯化

如图4所示，粗酶液经纯化得到大小略微小于66 kDa的单一条带，表明CCTreS在大肠杆菌内表达成功，且蛋白纯度较高，适合进行下一步酶学性质分析。

M1:Protein molecular weight marker；1:Recombinant enzyme purified on nickel column；2:Recombinant strain E.coli BL-21(DE3) containing pSE380-CCTreS；3:Recombinant strain E.coli BL-21(DE3) containing pSE380

图4表达产物CCTreS的SDS-PAGE检测分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of recombinant CCTreS

2.4最适温度和热稳定性

由图5可知，重组酶的最适反应温度为45℃，在35℃和40℃具有80%以上相对酶活力，60℃时酶活力不足10%。重组酶在25～35℃保存1 h后仍具有90%以上的相对酶活力，在60℃保存1 h后基本失活。

2.5最适pH值和pH稳定性

由图6可知，重组酶最适反应pH值为7.0，当pH值为5.0～7.5时，相对酶活力在75%以上，当pH 值小于5.0或大于9.0时，相对酶活力在40%以下；重组酶在pH值为7.0环境中酶活最高，稳定性最好，在pH值为5.5～8.5环境中稳定性也较好，相对酶活力在80%以上。

图5温度对CCTreS酶活力影响及热稳定性

Fig.5Effect of temperature on the activity and stability of CCTreS

图6pH值对CCTreS酶活力的影响及pH稳定性

Fig.6Effect of pH on the activity and stability of CCTreS

2.6金属离子和化学试剂对重组酶酶活力的影响

由图7可知，所用金属离子和化学试剂对重组酶均没有激活作用。Cu2+和Co2+对重组酶抑制作用明显，Ca2+、Mg2+、Ni2+以及5 mmol/L的SDS、DTT和10 mmol/L的EDTA均对重组酶有轻微抑制作用，Fe3+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、K+对酶活力的影响不大。

图7金属离子和化学试剂对CCTreS酶活力的影响

Fig.7Effect of metal ions and reagents on CCTreS enzyme activity

2.7产物分析

由图8～10可知，在最适温度45℃反应1.5 h,海藻糖产物含量达到最大值，但仅有45.82%，而在25℃和35℃条件下海藻糖最高含量分别能达到68.18%和59.21%，可见以麦芽糖为底物生产海藻糖的最高转化率随着温度的升高而减小；在反应48 h内，副产物葡萄糖的含量一直呈现增长状态，分别于25℃、35℃和45℃条件下反应48 h，葡萄糖的含量分别达到46.81%，79.32%和94.01%，这说明海藻糖合成酶的水解作用会一直伴随整个反应进程，温度越高水解作用越明显，副产物葡萄糖生成速度越快，随着反应的进行，海藻糖产物含量达到最大值后逐渐降低，而葡萄糖的含量则逐渐增加。

图825℃条件下CCTreS水解麦芽糖的产物组成分析

Fig.8Analysis of reaction time at 25℃ on the product composition of CCTreS

图935℃条件下CCTreS水解麦芽糖的产物组成分析

Fig.9Analysis of reaction time at 35℃ on the product composition of CCTreS

图1045℃条件下CCTreS水解麦芽糖的产物组成分析

Fig.10Analysis of reaction time at 45℃ on the product composition of CCTreS

2.8底物特异性的研究

由表1可知重组酶除了能催化麦芽糖反应外，还可以与海藻糖和蔗糖反应，但是催化蔗糖的反应是以水解作用为主，生成海藻酮糖的活力非常弱。

表1重组酶对不同底物的作用

Table 1Recombinant enzyme reaction with different substrates

底物Substrate对底物作用Effectonthesubstrate主要产物Mainproduct麦芽糖Maltose+海藻糖Trehalose海藻糖Trehalose+麦芽糖Maltose蔗糖Sucrose+果糖、葡萄糖Fructose,glucose果糖Fructose-葡萄糖Glucose-乳糖Lactose-淀粉Starch-糊精Dextrin-山梨糖Sorbose-麦芽三糖Maltotriose-海藻酮糖Trehalulose-普鲁兰糖Pullulan-纤维二糖Cellbiose-

注：+表示能作用；-表示不能作用

Note：+，work on substrate；-，do not work on substrate

3结论

本研究成功从纤维微菌克隆到海藻糖合成酶基因，并在大肠杆菌中实现高效表达。重组酶CCTreS的最适反应温度为45℃，最适pH值为7.0，在50℃以下及pH 值为4.5～9.0时具有较好的稳定性。Cu2+对酶活力的抑制作用较为明显，暂时没有找到对酶活力有激活作用的金属离子和化学试剂。CCTreS属于中温酶，但是在最适反应温度45℃条件下，海藻糖最高得率只有45%左右，水解作用较为明显，需要进行分子改造以提高其应用价值。与其它海藻糖合成酶不同的是，CCTreS转化蔗糖生成海藻酮糖的活力很弱，可以对其进行突变，探究转化海藻酮糖的关键位点。

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(责任编辑：陆雁)

Clonging，Expressionan and Characterization of a Novel Gene Encoding Trehalose Synthase from Cellulosimicrobium cellulans

曹磊1,2，刘滔滔1,2，张宏涛1,2，谢敏1,2，杜丽琴1,2，梁智群1,2，韦宇拓1,2**

CAO Lei1,2，LIU Taotao1,2，ZHANG Hongtao1,2，XIE Min1,2，DU Liqin1,2，LIANG Zhiqun1,2，WEI Yutuo1,2

(1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530005)

(1.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilizaiton of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi，530005，China)

摘要：【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术，从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列，进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS)，将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达，通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时，最适反应pH值为7.0，最适反应温度为45℃，40℃保温1 h仍具有80%以上的相对酶活力，在pH值5.5～8.5保存24 h，相对酶活力仍保留80%以上。Cu(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性，具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。

关键词：海藻糖合成酶纤维微菌反向PCR酶学性质

Abstract:【Objective】A new trehalose synthase was developed for application in industrial production of trehalose.【Methods】The complete ORF sequense of trehalose synthase gene was obtained from Cellulosimicrobium cellulans by inverse-PCR,and then it was amlified by PCR.The recombinant plasmid pSE380-CCTreS was constructed and transformed into Escherichia coli BL-21(DE3).The expressed protein was purified using nickel-nitrilotriacetic acid agarose resin.At last,the enzymatic characteristics of recombinant enzyme were studied.【Results】The trehalose synthase gene(CCTreS) was cloned from Cellulosimicrobium cellulans and successfully expressed in Escherichia coli.The optimum activity for the purified recombinant enzyme to convert maltose into trehalose was at 45℃ and pH 7.0.CCTreS had a good stability and could be reserved above 80% relative activity when it was placed in the environment at 40℃ for an hour or the environment in pH 5.5～8.5 for 24 hours.Cu(2+ )strongly inhibited the enzyme activity.【Conclusion】The recombinant enzyme has good thermal stability and pH stability,which provide certain research value and potential industrial application value.

Key words:trehalose synthase,Cellulosimicrobium cellulans,inverse-PCR,enzymatic characteristics

中图分类号：Q785,Q786

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0019-06

作者简介：曹磊(1991-)，男，硕士研究生，主要从事基因工程菌的构建及酶工程研究。

收稿日期：2015-11-16

修回日期：2016-02-26

*国家自然科学基金项目(31160311)和广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053051)资助。

**通讯作者：韦宇拓(1971-)，男，教授，主要从事发酵与酶工程研究，E-mail：weiyutuo@gxu.edu.cn。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):19～24

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.002.html