绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达*



绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达*

0引言

【研究意义】α-淀粉酶不能切割α-1，6糖苷键，但可以跨越α-1，6糖苷键作用于分支链内部的α-1，4糖苷键，产生的水解产物一般为麦芽糖、少量葡萄糖以及一些寡糖[1-2]。α-淀粉酶广泛应用于食品加工、纺织和制药行业[3-5]。麦芽糖α-淀粉酶是指能水解淀粉得到主要产物为麦芽糖和少量葡萄糖的一类酶的总称，来源于绿色糖单孢菌的麦芽糖α-淀粉酶水解淀粉的产物中麦芽糖含量可达70%(文献[6])，在麦芽糖浆和麦芽糖的工业生产上具有一定的应用前景。【前人研究进展】目前，应用大肠杆菌表达α-淀粉酶已经非常成熟，但是也存在一定的不足，如自身代谢产生内毒素、容易形成包涵体、产物分离纯化工艺复杂等。而应用枯草芽孢杆菌作为表达宿主具有很多优势，例如枯草芽孢杆菌被GRAS认定为安全级别的微生物、无明显的密码子偏好性、因蛋白分泌系统功能完善而具有很好的分泌能力等[7-8]，因此，枯草芽孢杆菌被广泛应用于食品、医药、饲料和环境保护等领域[9-12]。Kim等[13]将来源于枯草芽孢杆菌SHU4-2的麦芽糖α-淀粉酶基因在Bacillus subtilis168中表达，研究发现当培养基中出现淀粉、麦芽糖或者β-环糊精时，基因能够表达，而当存在葡萄糖、果糖或者蔗糖时，该基因不表达，说明该基因可能受到代谢产物的反馈抑制。2009年訾楠等[14]从地衣芽孢杆菌ATCC14580中克隆到一个麦芽糖α-淀粉酶基因，并成功在大肠杆菌中诱导表达；2011年转入枯草芽孢杆菌中表达，生成的麦芽糖α-淀粉酶几乎全部分泌到培养基中，采用HPLC检测产物，结果表明该酶催化水解淀粉的主要产物为麦芽糖；对菌株的产酶条件进行优化后，最高酶活达到5.9 U/mL。【本研究切入点】目前研究的麦芽糖α-淀粉酶大多是在大肠杆菌表达系统进行胞内表达，也有在枯草芽孢杆菌中进行分泌表达，但是表达量不高，同时，鉴于大肠杆菌表达系统存在的不足，因此有必要研究麦芽糖α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。【拟解决的关键问题】克隆绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因sva，并构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva，使其在宿主B.subtilis 1A857中表达，并对其发酵条件进行优化，期望得到高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

营养缺陷型表达宿主枯草芽孢杆菌1A857(培养时需添加必需氨基酸leuA、metB和trpC)和pHCMCO4大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体均购自BGSC；大肠杆菌Trans-10为本实验室保存；pSE-sva重组质粒和pHCMCO4-Pglv表达载体为本实验室构建并保存。

1.1.2主要酶和试剂

PrimerSTARHMHS DNA聚合酶和限制性内切酶SacⅠ均购自TaKaRa公司；DNA小量提取试剂盒、胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒等购自BioFlux博日公司。

1.1.3培养基

LB培养基(W/V):胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%；枯草芽孢杆菌1A857生长培养基和发酵培养基：葡萄糖1.5%(W/V)，蛋白胨15 g/L，酵母抽提物25 g/L，氯化钠10 g/L，(NH4)2SO420 g/L，另外再添加3种必需氨基酸leuA、metB、trpC，终浓度均为0.5%(W/V)。

1.2方法

1.2.1目的基因的扩增及重组质粒的构建

设计一对引物扩增pHCMCO4-Pglv表达载体，上游引物与下游引物各自含有与目的基因重叠的21个碱基(下划线部分)，即

Plvse-up:CACGTCGGCGCTCGCGTATGAA-

TATTACTTAGAGGATACTATTGAGA；

Plvse-down:GTCGCGTTCGCCGGGTGGTGCTGCCGCCGCTGCTGCAGAAT。

设计一对引物扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva，即

Sva-up：GCACCACCCGGCGAACGCGA；

Sva-down：TCATACGCGAGCGCCGACGTG。

以pHCMCO4-Pglv表达载体为模板，PCR扩增体系：5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Plvse-up 1 μL，Plvse-down 1 μL，template 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。载体PCR退火温度和延伸时间分别为68℃，7 min。以pSE-sva重组质粒为模板，采用两步法PCR扩增目的基因，PCR体系：5×PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Sva-up 1 μL，Sva-down 1 μL，template 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。退火和延伸同时进行，温度为68℃，时间为2 min。各取2.5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证PCR成功后用胶回收试剂盒回收目的条带，并用琼脂糖凝胶电泳分析验证回收目的片段的纯度。

花椒精油中还含有大量的酯类化合物，其中含有的乙酸芳樟酯化学性质较稳定，常温下不会变色，在皂用香精和高档香料产品的制造中经常会用到。精油中还有一些其他酯类化合物，比如乙酸松油酯，它是带有类似柠檬、薰衣草清香，气味有一些甜的物质，其香气停留时间相对较长，是我国颁布的《食品添加剂使用卫生标准》所允许使用的食品香料之一。此外，花椒精油中还含有乙酸异龙脑酯、乙酸香叶酯、乙酸-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己酯等酯类化合物，它们均为花椒香味的主要来源之一。除此之外，这些酯类化合物在医学上还具有镇静和止痉挛的治疗功效[7]。

采用Clontech公司的In-fusion HD cloning kit 融合连接两个目的片段，10 μL连接体系：5×In-fusion Enzyme Premix 2 μL，穿梭载体pHCMCO4-Pglv线性载体5 μL，sva 3 μL。将体系混匀置37℃恒温水浴15 min，然后立即于50℃水浴15 min，冰上冷却后转化2.5 μL大肠杆菌Trans-10感受态细胞。取200 μL转化产物涂布于带有Amp抗性的LB平板上，再置于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。挑取单菌落提质粒进行SacⅠ单酶切验证正确后送测序。1.2.2重组酶的表达及SDS-PAGE分析

将重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva转化枯草芽孢杆菌1A857进行表达，并以空质粒pHCMCO4-Pglv作为对照，分别以1%(V/V)的接种量转接于100 mL的LB培养基中(含有17 μg/mL的氯霉素Cm)，37℃，220 r/min摇床振荡培养，培养6 h后加入1.5%(W/V)麦芽糖诱导表达，从接种后开始每隔12 h取样，并用DNS[15]测定发酵液粗酶的酶活力。取麦芽糖诱导24 h的发酵液1 mL通过真空浓缩机浓缩至50 μL左右，与上样缓冲液按照1∶1(V/V)混合处理后进行10%(W/V)SDS-PAGE分析。

麦芽糖α-淀粉酶活力定义：在最适条件下，每分钟生成1 μmoL葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位(1 U)。酶活力的计算公式为

其中，G为葡萄糖含量(mg/mL);n为稀释倍数(mg/mL)；198.17为葡萄糖分子量；10为反应时间(min)；0.01为酶液体积(mL)。

1.2.3重组菌株培养条件的优化

1.2.3.1最适葡萄糖浓度

首先挑取单菌落转接于5 mL左右的LB培养基中过夜培养活化菌种，于500 mL三角瓶中加入30 mL葡萄糖浓度(W/V)分别为0.5%，1.0%，1.5%的发酵培养基(加入Cm终浓度为50 μg/mL)，同时加入3%(V/V)过夜培养的菌种，培养至菌体OD600值约为0.6时加入1.5%(W/V)麦芽糖诱导表达。每间隔6 h分别取样，在波长λ=600 nm下，将菌液适当稀释后，测定其OD600值，同时取发酵液测定胞外粗酶活。从含有1.5%(W/V)的葡萄糖这一组发酵液中取样，通过真空浓缩机浓缩至50 μL左右，与上样缓冲液按照1∶1(V/V)混合处理后进行10%(W/V)SDS-PAGE分析。

1.2.3.2最适氯霉素浓度

将重组菌株过夜活化后以3%(V/V)的接种量转接入到含有氯霉素浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的发酵培养基中，培养6 h至菌体OD600值约为0.6时加入1.5%(W/V)麦芽糖，在35℃，200 r/min恒温摇床进行诱导表达，收集菌液测定不同氯霉素浓度浓度下菌体的OD600值，并收集发酵液用DNS法测定粗酶的酶活力。

1.2.4重组菌株发酵条件优化

1.2.4.1单因素试验

(1)诱导温度：将重组菌株过夜活化后以接种量为3%(V/V)接入到发酵培养基(Cm终浓度为200 μg/mL)中，培养6 h菌体OD600值约为6时加入1.5%麦芽糖诱导表达，分别放置25℃，30℃，35℃，40℃恒温培养箱进行诱导表达，培养66 h后用DNS法测定粗酶活力。

(2)接种量：将重组菌株过夜活化后以1%，2%，4%，8%的接种量(V/V)接入到含有200 μg/mL氯霉素的发酵培养基中，培养6 h菌体OD600值约为6时加入1.5%麦芽糖在最适温度条件下恒温诱导表达，培养66 h后收集发酵液用DNS法测定粗酶活力。(3)装液量：将重组菌株过夜活化后以最适接种量转接于分别含有30 mL、50 mL、70 mL、90 mL发酵培养基(Cm终浓度为200 μg/mL)的500 mL三角瓶中，培养6 h菌体OD600值约为6时，加入1.5%麦芽糖在最适温度条件下恒温诱导表达，培养66 h后收集发酵液用DNS法测定粗酶活力。

1.2.4.2正交试验

在单因素试验的基础上，选择诱导温度、接种量和装液量进行L9(34)的正交实验，每组设计3个平行然后取平均值，按照表1进行试验，从而确定最优的发酵条件。

表1正交试验设计

Table 1The design of orthogonal test

因素Factor水平Level123装液量Liquidvolume(A,mL)253035接种量Inoculumsize(B,%)345诱导温度Inductiontemperature(C,℃)333537误差Error(E)---

2结果与分析

2.1目的基因的扩增和重组质粒的构建

如图1所示，PCR扩增得到大小约为1.4 kb和6.4 kb的两个DNA片段，这与预期目的基因的大小一致。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Maker;1:PCR product of pHCMCO4-Pglv；M2:W2003 DNA Marker; 2:PCR product of sva

图1PCR产物分析

Fig.1Digestion of PCR products

如图2所示，重组质粒经Sac Ⅰ单酶切后得到一条约为7.8 kb的条带，与预期的大小一致，说明目的片段已经连接到载体pHCMCO4-Pglv上，重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva构建成功。

M:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1，3:pHCMCO4-Pglv-svarecombinant plasmid；2，4：pHCMCO4-Pglv-svarecombinant plasmid digested withSacⅠ

图2重组质粒酶切分析

Fig.2Digestion of the recombinant plasmids

2.2重组酶活力的测定和SDS-PAGE分析

如图3所示，重组菌株在LB培养基中的酶活力随着培养时间的延长呈现先上升后下降的趋势，在培养120 h时达到最高酶活力，约为24 U/mL。SDS-PAGE分析发现，在55 kDa处出现一条蛋白条带，与预期目标蛋白大小相符(图4)，推断为绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶。

图3培养时间对重组酶活力的影响

Fig.3Effect of culture time on recombinant enzyme activity

M:Protein marker；1:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv-sva；2:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv

图4重组酶的SDS-PAGE电泳分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme

2.3重组菌株培养条件的优化

2.3.1最适葡萄糖浓度

根据相关文献，添加一定浓度的葡萄糖有助于营养缺陷型枯草芽孢杆菌的生长，但是葡萄糖浓度过高会产生代谢物反馈抑制。由图5和图6可知，当葡萄糖浓度为1.5%(W/V)时，菌体OD600值最大，约为27，酶活力也最高，达100 U/mL，均明显高于葡萄糖浓度为0.5%和1.0%(W/V)时的菌体OD600值和粗酶活力。说明1.5%(W/V)的葡萄糖浓度对重组菌产酶量的抑制作用还不是很明显，主要是作为碳源供菌体生长。此外，SDS-PAGE分析发现，在55 kDa左右出现明显的蛋白条带，与核酸序列理论推算的蛋白质分子量相符(图7)。

2.3.2最适氯霉素浓度

如图8所示，重组酶活力和菌体生长量均随着氯霉素浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当氯霉素浓度为200 μg/mL时，最高酶活力达到272 U/mL；重组菌在氯霉素浓度为100 μg/mL时生长最快。

图5　葡萄糖浓度对菌体生长的影响

图6葡萄糖浓度对重组酶活力的影响

Fig.6Effect of glucose concentrations on recombinant enzyme activity

M:Protein marker；1:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv-sva；2:Total soluble proteins of B.subtilis 1A857 containing plasmid pHCMCO4-Pglv

图7重组酶的SDS-PAGE电泳分析

Fig.7SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme

2.4重组菌株发酵条件优化

2.4.1单因素试验

如图9所示，重组菌的最适诱导温度为35℃，此时酶活力最高可以达到224 U/mL。当接种量为4%时酶活力最高，为265 U/mL，当接种量过大时，营养物质消耗快，后期产酶的积累减少，接种量较少时，菌体积累量不够，也影响产酶量的积累。装液量间接反映溶氧量对菌株产酶量的影响，试验结果表明，当装液量为30 mL时，培养66 h可以达到最高酶活力257 U/mL，说明重组菌对氧气的需求量很大。

图8不同氯霉素浓度下重组酶酶活力和菌体OD600

Fig.8The recombinant enzyme activity and OD600in different chloride concentration

图9单因素试验结果

Fig.9Result of single factor experiment

2.4.2正交试验

根据正交试验数据可以看出，最佳的发酵条件组合为A1B3C3，即最佳的发酵条件为装液量25 mL、接种量5%、诱导温度37℃，在此条件下，发酵液粗酶活力达到257.3698 U/mL(表2)。方差分析结果显示，SA>SB>SC，说明3个因素中对酶活力影响顺序为装液量>接种量>诱导温度；因为FA>F0.9(2,8)=3.110>FB>FC，所以装液量对重组菌的产酶量有显著影响，而接种量和诱导温度对产酶量的影响不显著(表3)。

表2正交试验结果分析

Table 2Results and analysis of orthogonal test

实验号TestnumberABCE酶活力Enzymeactivity(U/mL)11111189.32521222215.93931333257.37042123184.38652231194.70862312204.11573132107.60583213118.55193321121.765K1220.878160.421170.677168.599K2194.416176.399174.030175.881K3115.956194.430186.543186.769R104.92234.00915.86618.170

表3正交试验方差分析

Table 3Variance analysis of orthogonal test

因素Factor偏差平方和Quadraticsum自由度VarianceF比FratioF临界值Fcriticalvalue显著性ObviousnessA17864.92823.4823.110*B1737.01320.3393.110C419.54620.0823.110E501.72320.0983.110总和Sum20523.218

注：*表示影响显著

Note:*means significant influence

3讨论

麦芽糖α-淀粉酶有来源于细菌和真菌，细菌来源的麦芽糖α-淀粉酶基因主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜热放线菌(Thermus vulgaris)等[16-17]。而真菌麦芽糖α-淀粉酶几乎来源于丝状真菌中的曲霉属微生物，例如黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。而本研究中麦芽糖α-淀粉酶来源于绿色糖单孢菌，属于细菌，它作用于20%淀粉后生成的主要产物为麦芽糖、麦芽三糖和少量葡萄糖，其中麦芽糖的含量可以达到67.15%。

大肠杆菌因自身产生内毒素，从而限制了其在食品方面的应用。目前商业化的大肠杆菌表达系统主要用IPTG进行诱导表达，而IPTG不仅价格昂贵而且有毒，基于安全考虑，这也限制其在医疗和食品方面的重组蛋白表达的应用。另外因为大肠杆菌自身问题，在表达异源蛋白时很容易形成包涵体，从而使得可溶性蛋白表达量减少。

相较于大肠杆菌表达宿主，枯草芽孢杆菌因自身不产生内毒素而没有致病性，也没有明显的密码子偏好性，而且还具有很好的分泌能力[18]，能够将蛋白质直接分泌到胞外，避免了包涵体的形成，因此被认为是表达外源蛋白的理想宿主。根据文献[6]报道，sva在大肠杆菌宿主中表达的最高酶活力为168.699 U/mL，本研究在枯草芽孢杆菌中实现sva的高效分泌表达，胞外粗酶活力为257 U/mL。外源蛋白在枯草芽孢杆菌内表达量仍然不高，主要是因为:(1)枯草芽孢杆菌自身在对数生长期分泌表达大量的蛋白酶，能够将目的蛋白降解；(2)质粒的分化和结构不稳定；(3)信号肽的适配性选择。因此，目前研究热点一方面是寻找一个强启动子，包括诱导型的蔗糖启动子，木糖启动子，淀粉启动子以及组成型启动子P43;另外一方面是得到与目的基因高度适配的信号肽[19]。

4结论

本研究利用PCR技术成功克隆到目的基因sva，连接到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHCMCO4-Pglv，成功构建pHCMCO4-Pglv-sva，以B.subtilis 1A857为表达宿主实现分泌表达，并且通过菌体生长条件和发酵条件优化后，确定最佳的发酵条件为诱导温度37℃、接种量5%、装液量25 mL，在此条件下获得的胞外粗酶最高酶活力达到257 U/mL。

参考文献：

[1]TONKOVA A.Bacterial cyclodextrin glucanotransfera-

se[J].Enzyme and Microbial Technology,1998,22(8):678-686.

[2]MALHOTRA R,NOORWEZ S,SATYANARAYANA T.Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54[J].Letters in Applied Microbiology,2000,31(5):378-384.

[3]MURAKAMI S,NISHIMOTO H,TOYAMA Y,et al.Purification and characterization of two alkaline,thermotolerant α-amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and expression of the cloned gene in Escherichia coli[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2007,71(10):2393-2401.

[4]STEIN T,HEINZMANN S,DÜSTERHUS S,et al.Expression and functional analysis of the subtilin immunity genes spaIFEG in the subtilin-sensitive host Bacillus subtilis MO1099[J].Journal of Bacteriology,2005,187(3):822-828.

[5]BONGERS R S,VEENING J W,VAN WIERINGEN M,et al.Development and characterization of a subtilin-regulated expression system in Bacillus subtilis:Strict control of gene expression by addition of subtilin [J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(12):8818-8824.

[6]汪小波,李美蓉,李雪，等.绿色糖单孢菌高产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质[J].应用与环境生物学报,2013,19(2):342-345.

WANG X B，LI M R，LI X,et al.Gene cloning,expression and enzymatic characterization of a high maltose-producing α-amylase from Saccharomonospora viridis[J].Chin J Appl Environ Biol，2013，19(2):342-345.

[7]OLEMPSKA-BEER Z S,MERKER R I,DITTO M D,et al.Food-processing enzymes from recombinant microorganisms—A review[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2006,45(2):144-158.

[8]TOSATO V,BRUSCHI C.Knowledge of the Bacillus

subtilis genome:Impacts on fundamental science and biotechnology[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(1):1-6.

[9]刘国红,林营志,林乃铨，等.芽胞杆菌分类研究进展[J].福建农业学报,2011,26(5):911-917.

LIU G H，LIN Y Z，LIN N Q,et al.Study on genus Bacillus classification[J].Fujian Journal of Agriculture Sciences,2011,26(5):911-917.

[10]SCHALLMEY M,SINGH A,WARD O P.Developme-

nts in the use of Bacillus species for industrial production[J].Canadian Journal of Microbiology,2004,50(1):1-17.

[11]李明,双宝,李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J] .东北农业大学学报,2009,40(9):111-114.

LI M，SHUANG B，LI H T,et al.Progress and application of Bacillus subtilis in different fields[J].Journal of Northeast Agricultural Univercity,2009,40(9):111-114.

[12]王艳娜，张梁，丁重阳，等. 不同启动子调控羰基还原酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达水平[J].生物加工过程，2013，11(3)：46-51.

WANG Y N，ZHANG L，DING C Y，et al.Expression of carbonyl reductase in Bacillus subtilis with different promotes[J].生物加工过程，2013，11(3)：46-51.

[13]KIM D Y,CHA C H,OH W S,et al.Expression of the promoter for the maltogenic amylase gene in Bacillus subtilis 168 [J].Journal of Microbiology (Seoul,Korea),2004,42(4):319-327.

[14]訾楠,沈微,石贵阳，等.地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定[J].应用与环境生物学报,2009,15(1):130-133.

ZI N，SHEN W，SHI G Y,et al.Gene cloning and characterization of Bacillus licheniformis maltogenic α-amylase[J].Chin J Appl Environ Biol，2009,15(1):130-133.

[15]巩莉,华颖,刘大群，等.3,5-二硝基水杨酸法测定番茄废渣中糖分含量的研究[J].保鲜与加工,2014,14(3):37-42.

GONG L，HUA Y，LIU D Q，et al.Study on determination of sugar content from tomato residue with 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry[J].Storage and Process,2014,14(3):37-42.

[16]CHO H Y,KIM Y W,KIM T J,et al.Molecular characterization of a dimeric intracellular maltogenic amylase of Bacillus subtilis SUH4-2 [J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,2000,1478(2):333-340.

[17]KIM Y W,CHOI J H,KIM J W,et al.Directed evolution of Thermus maltogenic amylase toward enhanced thermal resistance[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(8):4866-4874.

[18]POHL S,HARWOOD C R.Heterologous protein secretion by Bacillus species:From the cradle to the grave[J].Advances in Applied Microbiology,2010,73:1-25.

[19]KIM J H,HWANG B Y,ROH J,et al.Comparison ofPapr E,Pamy E,and PP43 promoter strength for β-galactosidase and staphylokinase expression in Bacillus subtilis[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2008,13(3):313-318.

(责任编辑：陆雁)

High Level Secretion Expression of Maltogenic α-amylase from Saccharomonospora viridis in Bacillus subtilis

柳梅梅1,2，谢敏1,2，杨燕芳1,2，刘滔滔1,2，杜丽琴1,2，梁智群1,2，韦宇拓1,2**

LIU Meimei1,2，XIE Min1,2，YANG Yanfang1,2，LIU Taotao1,2，DU Liqin1,2，LIANG Zhiqun1,2，WEI Yutuo1,2

(1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530005)

(1.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilizaiton of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi，530005，China)

摘要：【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva，再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接，构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达，对重组酶进行SDS-PAGE分析，然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达，SDS-PAGE分析发现，在55 kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示，重组菌的最适诱导温度为35℃，最适接种量为4%(V/V)，最适装液量为30 mL。正交实验结果显示，重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25 mL，在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698 U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，经发酵条件优化后，重组酶产量显著提高10倍左右。

关键词:麦芽糖α-淀粉酶枯草芽孢杆菌高效表达优化

Abstract:【Objective】 Engineering strains for high yield of maltose alpha amylase were constructed in order to implement efficient secrection expression.【Methods】The gene that had a length of 1 440 bp was amplified by PCR.The recombinant plasmid pHCMCO4-Pglv-sva was constructed and transformed into Bacillus subtilis.The recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE,and the growing conditions of recombinant strains were further optimized.【Results】The recombinant strain pHCMCO4-Pglv-sva was successfully constructed and expressed in Bacillus subtilis.The molecular weight of the recombinant protein was approximately 55 kDa by SDS-PAGE analyis.Single factor optimization of fermentation conditions revealed that the recombinant strain had the optimal induction temperature at 35℃,the optimal inoculated quantity of 4%(V/V) and the optimal loading fluid amount of 30 mL.Orthogonal experiment results showed that the optimum fermentation conditions were induction temperature at 37℃,quantity of 5%(V/V) and fluid volume 25 mL,under which the enzyme activity of recombinant maltose alpha amylase reached to 257.3698 U/mL.Among them,liquid loading quantity had significant effects on enzyme activity of maltose alpha amylase.【Conclusion】The recombinant plasmid pHCMCO4-Pglv-sva was successfully built and maltose alpha amylase was highly increased to ten times after optimizing fermentation condition.

Key words:maltose α-amylase，Bacillus subtilis，high efficient expression，optimization

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0012-07

作者简介：柳梅梅(1989-)，女，硕士研究生，主要从事基因工程菌的构建和酶工程研究。

收稿日期：2015-11-16

修回日期：2016-02-28

*国家自然科学基金项目(31160311)和广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053051)资助。

**通讯作者：韦宇拓(1971-)，男，教授，主要从事发酵与酶工程研究，E-mail：weiyutuo@gxu.edu.cn。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):12～18

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1511.016.html