生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达*



生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达*

0引言

【研究意义】淀粉能被多种淀粉酶水解，但这些酶中大约只有10%能结合并降解生淀粉[1]，其中生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting glucoamylase，RSGA)是一种可以水解生淀粉的葡萄糖糖化生淀粉酶，可直接将未经蒸煮糊化的生淀粉降解成为葡萄糖，并可将淀粉发酵酒精中的糊化、液化、糖化三步变为一步，省去现代工业发酵生产酒精过程中的淀粉前期处理工艺，节约能源消耗，降低发酵生产酒精的成本。RSGA通常具有一个明显的序列结构模块，即淀粉结合域SBD(Starch-binding domains,SBD)[2]。真菌中的糖化酶所含有的SBD序列一般包括大约100个氨基酸残基，是一个由7个β链组成扭曲而且开放的β桶形结构[3-4]。文献[2,5]证明，SBD可以在整个蛋白结构中保持独立的功能，与糖化酶或淀粉酶融合后可显著增加不溶性淀粉在酶分子活性中心的浓度，赋予普通糖化酶或淀粉酶降解生淀粉的能力。【前人研究进展】现已发现在细菌、真菌的α-淀粉酶、β-淀粉酶、细菌的环糊精转移酶以及真菌的糖化酶中都存在淀粉结合域[6]。本实验室杨键等[7]将SBD插入α-淀粉酶(CN7A)基因的5′端融合表达，淀粉酶酶活提高8.7倍，另有研究证明来源米根霉的糖化酶生淀粉酶活力显著，生淀粉利用率为65%～70%，可以通过基因克隆和融合表达的方式，进一步提高生淀粉酶的活力。【本研究切入点】目前对该结合域融合表达的研究较少，而将淀粉结合域连接到糖化酶实现融合表达的研究国内并未有报道。【拟解决的关键问题】笔者在前期的工作中筛选得到一株产酸性糖化酶的黑曲霉ASP-S21，该酶在酸性条件下稳定性好且酶活力高，但降解生淀粉的酶活较低。经基因测序发现该基因未含有生淀粉结合域，因此将实验室原保藏的米曲霉生淀粉结合域SBD片段与糖化酶基因在毕赤酵母中融合表达，提高其水解生淀粉能力和表达量，以期得到能在酸性环境下降解生淀粉的糖化酶。

1材料和方法

1.1材料

黑曲霉ASP-S21由本实验室筛选，pPIC9K载体及毕赤酵母GS115 来自Invitrogen 公司。基因操作相关酶购自大连TaKaRa生物工程公司，反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas，酵母基因组DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、小型质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司，其他试剂为国产或进口的分析纯和生化试剂，实验所用到的YPD、BMGY、BMMY培养基均按Invitrogen公司酵母操作手册方法配制。

1.2引物的设计及合成

根据已报道的黑曲霉糖化酶基因序列及淀粉结合域SBD基因序列，参照In-fusion TM PCR Cloning Kit 的使用说明，将SBD片段及糖化酶基因片段通过引物的退火互补串联连接，再将串联片段连接入载体pPIC9K，为此，设计以下引物，下划线分别为引入的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ：

psg1-1：5′ -AGCTTACGTAGAATTCGCAA-

GTATTCCTAGCAGTGCTT-3′,

psg1-2：5′-GCGCTTGGAAATCACTGTAGA-

TACTTGGTAATTGGCA-3′;

psg2-1：5′-TACCAAGTATCTACAGTGATT-

TCCAAGCGCGCGACCTTG-3′,

psg2-2：5′-AATTAATTCGCGGCCGCCTAG-

AGATTCCGCCAGGTGT-3′;

pg-1：5′-ATAGAATTCGTGATTTCCAAGC-

GCGCGACCTTG-3′,

pg-2：5′-TAAGCGGCCGCCTAGAGATTCC-

GCCAGGTGT-3′。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3重组毕赤酵母表达质粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg的构建

利用液体筛选培养基培养黑曲霉，收集菌体，菌体用液氮研磨后，用mRNA 抽提纯化试剂盒提取mRNA。以黑曲霉mRNA 做模板，根据反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的使用指南合成黑曲霉的双链cDNA。以pg-1/pg-2为引物，以cDNA为模板PCR扩增，将PCR扩增得到的glu片段经纯化后，用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后，与同样双酶切的载体pPIC9K用T4连接酶连接，转化至E.coli JM109，涂布在氨苄抗性的LB平板，抽提阳性转化子，用EcoRⅠ、NotⅠ酶切验证与测序，得到正确的表达载体命名为pPIC9K-pg。

利用In-Fusion克隆技术得到的SBD-glu串联片段与载体pPIC9K按照上述方法构建表达载体pPIC9K-psg。

1.4酵母转化与高拷贝转化子筛选

利用XbaⅠ酶切位点对重组质粒pPIC9K-pg与pPIC9K-psg进行线性化后，电转化毕赤酵母GS115，电转化方法参见Invitrogen公司操作手册。利用MD和MM平板进行转化子筛选，在不同G418浓度(0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.50 mg/mL、2.00 mg/mL)的YPD培养基平板进行高拷贝转化子筛选。

1.5转化子的诱导表达及SDS-PAGE检测

挑取有高拷贝数的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-psg、GS115/pPIC9K-pg转化子，接种至5 mL BMMY液体培养基，过夜培养至OD600达到2.0～4.0，5 000 r/min离心5～10 min收集菌体，再用BMGY液体培养基重悬细胞至OD600为1.0，进行诱导表达，每隔24 h补加甲醇以继续诱导，72 h后收集酶液，测定酶活，同时8 000 r/min离心10 min取上清液，利用SDS-PAGE电泳分析表达产物[8]。

1.6酶活力测定

将0.4 mL的1%(W/V)可溶性淀粉与0.3 mL pH值为4.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L)混合后置于65℃保温10 min，再加入0.1 mL适当稀释的酶液，反应10 min后，立即加入0.8 mL的3，5-二硝基水杨酸(DNS)终止反应并测定还原糖。以在上述条件下反应后，每分钟产生1 μmol还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.7酶的生淀粉降解性质分析

用pH值为4.4柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L)配制成1%(W/V) 的木薯生淀粉悬液作为底物。首先在50 mL的锥形瓶中加入4 mL底物，50℃ 预热10 min，再加入经过适当稀释的酶液1 mL，50℃恒温振荡(180 r/min)反应1 h后，加入0.5 mL、4% (W/V)NaOH终止反应，最后取适当体积的反应液于5 000 r/min离心5 min，取上清液用DNS法测定还原糖量[9]。

1.8生淀粉降解能力(RDA)计算

根据文献[9]的方法，RDA=B/A×100% ，其中B为降解生淀粉酶活，A为降解糊化淀粉酶活。

1.9PSG和PG最适条件及热稳定性分析

PSG及PG酶液在65℃下分别保温1 min、3 min、5 min、10 min和15 min取出后测定其残余酶活，绘制融合酶与原始酶的时间与残余酶活之间的关系曲线。在不同温度(40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、90℃)下测定pH值为4.4条件下的酶活力，绘制温度与相对酶活之间的关系曲线。以不同pH值(2.2，3.0，4.0，4.4，5.0，5.4，6.0，6.4，7.0，8.0，9.0)缓冲液配制的可溶性淀粉溶液为底物，在65℃分别测定融合酶与原始酶的酶活，得到pH值与相对酶活的关系曲线。

2结果与分析

2.1重组质粒pPIC9K-pg与pPIC9K-psg的构建

利用所设计的3对引物PCR扩增得到黑曲霉糖化酶基因glu及淀粉结合域SBD基因片段(图1)，将图1中2号位的片段连接上T载体后测序，在NCBI上进行比对确定该片段为不含生淀粉结合域的黑曲霉糖化酶基因glu。

1:DL2000 DNA Marker;2:PCR product of glu;3:PCR product of SBD

图1glu和SBD PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

Fig.1Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of glu and SBD

由图2显示，构建的重组质粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg进行酶切鉴定、测序，确定糖化酶基因glu与淀粉结合域SBD均与表达载体pPIC9K的α因子信号肽3′端融合，并且阅读框架正确无误。

1:λDNA/HindⅢ;2:pPIC9K-psg/EcoRⅠ,NotⅠ;3:pPIC9K-pg/EcoRⅠ,NotⅠ

图2重组质粒pPIC9K-pg及pPIC9K-psg的酶切验证

Fig.2Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmid pPIC9K-pg and pPIC9K-psg

2.2重组质粒pPIC9K-psg与pPIC9K-pg的诱导表达

由图3可知，含pPIC9K-psg与pPIC9K-pg转化子的发酵液与不含质粒的原始菌比较均多出一条约为101 kDa大小的蛋白条带，表明目的蛋白得到了分泌表达。但PG及PSG表达蛋白所表现出的实际分子质量均大于理论值，因此推测这是毕赤酵母对目的蛋白进行糖基化修饰的结果。

Mark：蛋白质分子质量标准；1：重组酵母GS115/pPIC9K;2：重组酵母GS115/pPIC9K-pg;3：重组酵母GS115/pPIC9K-psg

Mark:molecular mass markers;1:Recombinant yeast GS115/pPIC9K;2:Recombinant yeast GS115/pPIC9K-pg;3:Recombinant yeast GS115/pPIC9K-psg

图3PSG及PG在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE

Fig.3SDS-PAGE analysis of PSG and PG expression in P.pastoris

2.3融合酶PSG及原始酶PG的酶学性质比较

2.3.1糖化酶活力以及水解生淀粉能力

由表1可知，PG测得糖化酶活力为7.72 U/mL，生淀粉酶活力为1.84 U/mL，RDA值为23.8%。转化子PSG糖化酶活力为7.81 U/mL，生淀粉酶活力为2.64 U/mL，RDA值为33.8%。降解生淀粉的能力较未加SBD结合域的菌株提高29.6%，比原始菌株提高86.5%。

2.3.2最适作用条件及热稳定性分析

由图4～6可知，融合酶的热稳定性并没有显著变化。最适作用温度，最适作用pH值也与原始酶相同，分别为65℃和4.8，但在高温条件(70～85℃)及偏酸性、碱性条件(pH值为4.0,6.4～8.0)下融合酶的相对酶活均有所提高。

表1PSG与PG的糖化酶活力以及水解生淀粉能力比较

Table 1Comparision of glucoamylase activity and raw cassava starch hydrolyzing activity between the fusion enzyme and the wildtype

菌株编号Strainnumber糖化酶活力Glucoamylaseactivity(U/mL)生木薯粉酶活Rawcassavastarchhydroly-sisactivity(U/mL)生淀粉降解能力RDA(%)ASPS21136.34±0.240.39±0.084.57±0.25PG37.72±0.351.84±0.0523.80±0.80PSG27.81±0.212.64±0.1433.80±1.43

图4　PG及PSG在65℃下的热稳定性

图5　温度对PG及PSG酶活力的影响

图6pH值对PG及PSG酶活力的影响

Fig.6pH value effects on PG and PSG activity

3结论

本研究将筛选得到的黑曲霉ASP-S21糖化酶基因与实验室原有的米曲霉SBD生淀粉结合域基因在毕赤酵母中融合表达，对融合酶与原始酶的酶学性质进行分析，可知：(1)测得原始酶转化子的PG糖化酶酶活力为7.72 U/mL，生淀粉酶活力为1.84 U/mL，RDA值为23.8%；融合转化子的PSG糖化酶活力为7.81 U/mL，生淀粉酶活力为2.64 U/mL，RDA值为33.8%。(2)PSG降解生淀粉的能力比PG提高29.6%，比原始菌株提高86.5%，即融合酶较原始酶具有降解生淀粉的能力。(3)融合酶的最适反应温度、pH值及热稳定性均与原始酶基本相同，但反应温度及pH值的范围均变得更为宽泛，融合酶在反应温度60～70℃，pH值为4.0～7.0时较为稳定。该融合酶对用生淀粉发酵生产酒精具有重要的推动作用。

参考文献：

[1]ROMINA R S,NORMA O,SERGIO S.Microbial

starch-binding domain[J].Current Opinion in Microbiology,2005,8:260-267.

[2]缪可嘉,王正祥.淀粉酶系中淀粉结合域的结构和功能的研究进展[J].食品工业科技,2007(3):242-245.

MIAO K J,WANG Z X.The structure and function of starch-binding domain(SBD) in starch combination with field research progress[J].Science and Technology of Food Industry,2007(3):242-245.

[3]LAWSON C L,VAN MONTFORT R,STROKOPYT-

OV B,et al.Nucleotide sequence and X-ray structure of cyclodextrin glycosyhransferase from Bacillus circulans strain 251 in a maltose-dependent crystal form [J].J Mol Biol，1994，236(2)：590-600.

[4]SORIMACHI K,JACKS A J,LE GAL-COЁFFET M

F,et al.Solution structure of the granular starch binding domain of glucoamylase from Aspergillus niger by nuclear magnetic resonance spectroscopy [J].J Mol Biol，1996，259(5)：970-987.

[5]季勤，JEAN-PAUL V，KRIT R,等.SBD在重组蛋白质中位移对其酶活性及与淀粉粒结合性能的影响[J].南京师大学报：自然科学版,2005,28(1):88-92.

JI Q，JEAN-PAUL V,KRIT R,et al.Effect of SBD’s position in fusion proteins on activity and binding properties[J].Journal of Nanjing Normal University:Natural Science,2005,28(1):88-92.

[6]WANG Q H,WANG X Q,WANG X M.Glucoamylase production from food waste by Aspergillus niger under submerged fermentation[J].Process Biochemistry,2008,43(3):280-286.

[7]杨键,金辉,王青艳,等.淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质[J].生物加工过程,2010,8(5):40-43.

YANG J,JIN H,WANG Q Y,et al.Fusion expression of starch binding domain with α-amylase and its properties[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineerin,2010,8(5):40-43.

[8]曾庆梅,魏春燕,靳靖,等.黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J].食品科学,2011,32(17):219-224.

ZENG Q M,WEI C Y,JIN J,et al.Cloning of acid-stable of amylase gene from Aspergillus niger and its expression in Pichia pastoris[J].Food Science,2011,32(17):219-224.

[9]李凤玲，张璐，刘连成，等.生淀粉糖化酶产生菌Cellul-

osimicrobium sp.SDE的分离鉴定及酶学性质的研究[J].工业微生物，2008,10(5):45-49.

LI F L,ZHANG L,LIU L C,et al.Isolation of RSGA-producing strain Cellulosimicrobium sp.SDE and its enzymatic properties[J].Industrial Microbiology,2008,10(5):45-49.

(责任编辑：竺利波)

Fusion Expression of Raw Starch Binding Domain with Glucoamylase in Pichia pastoris

朱婧，刘海余，王青艳，米慧芝，朱绮霞，廖思明，秦艳，申乃坤，黄日波**

ZHU Jing,LIU Haiyu，WANG Qingyan,MI Huizhi,Zhu Qixia,LIAO Siming,QIN Yan,SHEN Naikun,HUANG Ribo

(广西科学院 国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西南宁530007)

(National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning，Guangxi，530007，China)

摘要：【目的】研究生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达，提高酶的表达量和水解生淀粉的能力。【方法】利用In-fusionTM PCR克隆技术将淀粉结合域SBD无缝隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5′端构建融合表达质粒pPIC9K-psg，实现融合酶基因psg在毕赤酵母GS115中的高效表达，并进行酶学性质研究。【结果】融合酶的最适作用条件及热稳定性均与原始酶无明显差别，但反应温度及pH值的范围更为宽泛，在反应温度60～70℃，pH值为4.0～7.0时均较稳定；融合酶PSG降解生淀粉的能力较原始酶PG提高29.6%，比原始菌株提高86.5%。【结论】淀粉结合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。

关键词：黑曲霉ASP-S21生淀粉糖化酶淀粉结合域In-fusion TM PCR Cloning融合表达毕赤酵母GS115

Abstract:【Objective】In order to improve the expression of glucoamylase from Aspergillus niger ASP-S21 and the hydrolysis ability of raw starch,the fusion expression of starch binding domain(SBD) with glu was conducted in Pichia pastoris GS115.【Methods】The fusion expression plasmid was constructed by inserting the SBD fragment to 5′-end of glucoamylase gene glu with In-fusionTM PCR Cloning technology.The recombinant enzyme(PSG)was over expressed in Pichia pastoris GS115 and its enzymatic properties were characterized.【Results】The PSG showed strong raw cassava starch hydrolyzing activity，which was 29.6% higher than the wildtype PG,and 86.5% higher than parental strain.The reaction temperature and pH of the acfusion enzyme were more broad than that of the wildtype.It was stable in temperature range of 60～70℃ and pH range from 4.0 to 7.0.【Conclusion】The fusion of SBD with glucoamylase enables the fusion enzymes to hydrolyze raw starch more effectively.

Key words:Aspergillus niger ASP-S21,raw starch-digesting glucoamylase,starch-binding domain(SBD),In-fusionTM PCR Cloning,fusion expression,Pichia pastoris GS115

中图分类号：TS231，Q786

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0007-05

作者简介：朱婧(1983-)，女，助理研究员，主要从事发酵工程方面的研究。

收稿日期：2015-01-27

修回日期：2015-03-12

*国家自然科学基金项目(No.31160023)，广西科学研究与技术开发计划项目(桂科合14123001-19)，广西自然科学基金项目(No.2013GXNSFBA019102)，八桂学者建设工程专项经费和2014年留学人员科技活动项目资助。

**通讯作者：黄日波(1958-)，男，教授，博士生导师，主要从事微生物生物技术以及酶工程研究，E-mail:rbhuang@163.com。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):7～11

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1516.036.html