种子热激蛋白研究进展

陈泉竹，毛培胜

(1.中国农业大学动物科技学院，草业科学北京市重点实验室，北京 100193; 2.成都市发展和改革委员会，四川成都 610093)

种子热激蛋白研究进展

陈泉竹1，2，毛培胜1

(1.中国农业大学动物科技学院，草业科学北京市重点实验室，北京 100193; 2.成都市发展和改革委员会，四川成都 610093)

植物种子在成熟、贮藏与萌发中会合成大量蛋白质，其中包括具有重要作用的热激蛋白。研究种子热激蛋白的结构与功能，能够揭示热激蛋白与种子正常发育、抵抗高温等逆境胁迫的相关性，阐释热激蛋白在种子中的作用机理。通过培育具有抵抗高温逆境的种子可以提高植物种子活力、保护种质资源，实现种子生产的高产与稳产以达到推动农业经济发展的目的。本文从热激蛋白的合成、分类、特点与功能等方面进行了概述，并详细分析了热激蛋白在植物种子成熟、贮藏和萌发中的作用，并对热激蛋白在蛋白质组学上的研究进行了总结。提出利用蛋白质组学分析牧草种子劣变过程中热激蛋白合成类型与数量的应用前景。

热激蛋白;植物种子;蛋白质组学

新收获的种子在其生理成熟时活力最高，受外界环境条件的影响，收获后贮藏种子会出现不可逆的衰老，从而导致种子活力下降。种子活力与环境温度有着直接的联系，突然的高温或结冰，会给种子带来一系列生理生化变化，并导致蛋白质变性、核酸合成系统受破坏或细胞膜被损坏，从而引起种子劣变，即活力下降的不可逆变化［1-2］。在种子采收、加工和贮藏过程中，高温高湿的环境会使种子发生不同程度的劣变，对种子的质量造成较为严重的影响［3-5］。

在贮藏过程中，暴露于过热环境中的种子会产生一系列的细胞代谢反应，一些正常蛋白质的合成会减少，同时一类新的蛋白质即热激蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)的合成增加［6-7］。作为高温诱导产生的一类蛋白质，热激蛋白的一个重要功能就是参与种子的抗热反应过程，提高细胞对热逆境的抗性［8-9］。热激蛋白与植物种子的抗逆能力以及寿命有着十分密切的关系，在蛋白组学水平上对高温劣变的种子进行研究可以帮助人们寻找与耐热相关的蛋白，从分子生物学的角度了解其表达特性与作用机理。

1 热激蛋白的合成与分类

1962年Ritossa［10］在研究果蝇时首次发现了热激蛋白，而直到1974年科学家才从生物体内正式分离出热激蛋白。

植物处于高温状态时，体内正常的蛋白合成受到抑制，同时某些基因开始表达从而合成热激蛋白［11］。真核细胞HSP基因的转录调节过程包括热激因子(HSF)的激活、HSF与热激元件(HSEs)的结合及HSPs基因的转录3个步骤［12］。植物合成HSP的最适温度随植物的不同而改变。通常认为，诱导合成HSPs的最适温度比正常生长温度高出10℃［13］。

根据相对分子质量的大小和同源程度，HSPs可以分为五大类［14］: HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和smHSPs (小分子量热激蛋白)。其中smHSPs又可分为细胞质Ⅰ类、细胞质Ⅱ类、叶绿体、线粒体和内质网smHSPs［15-16］。高等植物中最为丰富的热激蛋白是分子量为15～42 kD的smHSPs，这也是种子中常见的热激蛋白组分［17-18］。

2 热激蛋白的特点和功能

2.1热激蛋白的特点

热激蛋白具有保守性、反应短时性、交叉耐受性、诱因多样性和种类多样性5个方面的特点［19-20］。植物热激蛋白的显著特点是smHSPs相当多，已研究过的植物大多都能合成20多种smHSPs［21］。

2.2热激蛋白的功能

热激蛋白都具有分子伴侣作用［22］。研究表明，正是HSPs的分子伴侣功能才使植物细胞有了耐热能力［23-24］。小分子量热激蛋白的表达可以提高植物的耐热性，能够调节膜脂的多态性，稳定膜的液晶相，并且增加液体相分子排列的有序性［25-27］。刘箭和庄野真理子［28］通过研究高温下热激蛋白对柠檬酸合成酶、花粉粒及线粒体的保护作用，证明线粒体小分子热激蛋白可以提高细胞的耐热能力。

热激蛋白与植物的抗寒性有关。Collins等［29］先对绿豆(Vigna rabiata)进行热激，再置于冷胁迫中，发现组织的抗冷性明显增强。赵春梅等［30］利用农杆菌介导法，将内质网smHSPs基因导入番茄(Lycopersicon esculentum)，在低温胁迫下其抗冷性明显好于未转基因番茄和转空载体番茄。

3 热激蛋白在植物种子中的作用

表1 热激蛋白在种子中的作用Table 1 The role of heat shock proteins in seed

热激蛋白在种子发育、贮藏及萌发中有重要的作用(表1)。热激蛋白主要参与种子中新生肽的折叠、运输和组装，具有分子伴侣的功能，并参与逆境损伤蛋白的修复和降解等，有利于增强种子的胁迫耐性和与种子寿命相关的耐贮藏能力，并保持种子的代谢系统在胁迫环境下的正常功能［31-32］。而且，热激蛋白对维持种子本身的功能有重要的意义。种子成熟后，在高温环境下发生劣变时，HSP mRNA和HSPs的积累对种子抵抗高温逆境、保持活力有着非常重要的作用。

3.1热激蛋白增强种子的胁迫耐性

热激蛋白作为一种逆境蛋白质，对于灌浆期、成熟贮藏期以及萌发期的种子都有抵抗环境胁迫的作用，包括抗热性、抗寒性和抗旱性等。

试验证明，热激蛋白不仅可以增加种子的耐热性，还能够提高种子的耐寒性。王广印等［33］研究了高温对萝卜(Raphanus sativus)种子萌发的影响，30℃以上的温度不利萝卜种子的萌发，而对萝卜种子进行较高温度的预处理之后可以提高种子在35℃萌发时的耐高温性，同时还能提高种子萌发耐低温的能力，由此可见萝卜种子在高温逆境中获得了交叉耐受性，而这种耐受性的产生则与高温处理下诱导的热激蛋白有关。为了深入了解种子发育过程中小分子量热激蛋白的功能与调节机制，Wehmeyer和Vierling［17］通过蛋白印迹分析和在转基因植物中导入HSP17.4-β-GUS报告基因，研究了拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型种子与成熟突变体种子中的小分子量热激蛋白的表达。结果显示，小分子量热激蛋白在不耐旱的拟南芥种子中含量下降，而在胚有缺陷但耐旱的突变体中含量上升。表明小分子量热激蛋白对种子的耐胁迫性有一个普遍的保护作用。

近年来，利用蛋白质组学和基因组学对种子热激蛋白的表达模式和数据分析能够进一步阐明其与种子胁迫耐性的关系，从而探讨热激蛋白在种子中的功能与作用机理。Majoul等［34］对灌浆期的六倍体小麦(Triticum aestivum)种子进行不同温度和时间的热激处理后，共有36种蛋白质的含量比对照明显增加，同时诱导产生了一种新的蛋白质，通过比对发现这些蛋白质中包括热激蛋白，表明种子在高温劣变中通过合成热激蛋白来抵抗高温逆境。

3.2热激蛋白保持种子活力

种子中热激蛋白的合成能力可以影响到种子活力的水平，热激蛋白的大量合成能够提高种子活力。20世纪90年代末，黄上志［35］为了寻找与种子活力密切相关的热激蛋白，对不同活力的卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)种子进行热激处理，发现高活力和中等活力的卷心菜种子能够合成一些热激蛋白，而在低活力种子中检测不到，并最终确定一种HSP70与种子活力有关。刘军等［36］进一步对不同活力玉米(Zea mays)种子胚的蛋白质进行研究，通过SDS-PAGE的分离与蛋白质合成的放射自显影技术，发现种子活力与种子萌发时胚贮藏的蛋白降解效率及新蛋白合成能力一致，而且玉米胚吸胀24 h时蛋白质合成能力、贮藏蛋白质降解程度可以作为衡量玉米种子活力的生化指标。

21世纪以来，热激蛋白在种子活力方面的生物学功能所具有的理论价值和应用前景成为科学家们关注的一个焦点，大量试验通过蛋白质组学的方法对这一问题进行研究。林信海［37］利用TCA－丙酮沉淀法提取人工老化后的3个不同活力水平的玉米种子胚的蛋白质，通过蛋白质双向电泳和肽质量指纹图谱技术分析提取的蛋白质组;采用PDQuest 8.0.1软件对电泳图像进行分析找到表达量超过2倍的蛋白质进行质谱鉴定，共成功鉴定出22个蛋白质，其中包括数个热激蛋白，这些蛋白对种子活力有多方面的影响，包括能量代谢、细胞生长、细胞内生物大分子的合成和防御系统等。

目前，科学家们利用基因表达和植物转基因等方法研究热激蛋白对种子萌发活力的重要作用。周玉亮［38］研究了莲(Nelumbo nucifera)种子里的金属硫蛋白和细胞质Ⅱ类小分子量热激蛋白在种子中的生物学功能，采取基因表达和植物转基因的方法，通过利用莲种子和转基因拟南芥种子，揭示了上述蛋白在逆境条件下对于种子萌发活力的重要作用，证明了莲种子的金属硫蛋白基因和小分子量热激蛋白基因在种子活力方面确实有一定的生物学功能，能够提高种子的耐热性，同时增强种子活力。

3.3热激蛋白增强种子贮藏能力

对于贮藏的成熟种子而言，在高温环境中，热激蛋白能够修复及降解损伤蛋白，稳定多肽链，保持正常蛋白质的活性，从而增强与种子寿命相关的贮藏能力。

高家东［39］通过筛选得到两种耐贮藏能力不同的杂交水稻种子，分别是耐贮藏组合博优998和不耐贮藏组合Ⅱ优998，提取这两个组合贮藏前后的胚蛋白质进行蛋白质组学分析，研究表明在贮藏后鉴定到28个差异蛋白，其中耐贮藏组合博优998上调蛋白数为9个，这些蛋白属于LEA蛋白、DNA损伤修复类蛋白等，这证明了热激蛋白的合成与种子的贮藏能力有正相关性。Kalemba和Pukacka［40］对自然条件下贮藏年限不同而有不同活力的山毛榉(Fagus sylvatica)干种子的子叶和胚轴进行研究，通过蛋白免疫印迹和微密度分析等方法，测定了两种小分子量热激蛋白和一些脱水蛋白与种子活力的相关性，发现在贮藏时间最长也即活力低的种子中热激蛋白的含量越高，两者呈显著的正相关性，说明热激蛋白对贮藏种子具有保护作用。

3.4热激蛋白维持种子本身的功能

热激蛋白对维持种子本身的功能有重要的意义。有学者在拟南芥［41］、豌豆(Pisum sativum)［42］和向日葵(Helianthus annus)［43］等植物种子中发现在种子胚胎发育后期以及种子成熟过程中有非胁迫引起的小分子量热激蛋白积累的现象。林晓东等［44］发现HSP70s家族中的特异蛋白BiP和HSP60s家族中的PDI作为组成型的热激蛋白(HSC)存在于常态的细胞中，参与玉米胚发育的正常生命活动。

4 热激蛋白的蛋白质组学研究

20世纪90年代中期，后基因组时代迎来了一门从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成和活动规律的新兴学科——蛋白质组学。Wilkins和Williams在1994年首次提出蛋白质组的概念，目前研究重点已经从基因组学转移到蛋白质组学。在蛋白质组学研究中，使用的主要技术有双向凝胶电泳分离技术和质谱鉴定技术［45］。蛋白质组学研究的范围主要包括表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学［46-48］，其中涉及较多的是差异表达蛋白质组学和功能蛋白质组学(表2)。植物热激与种子老化过程中都会发生一系列生理生化反应，诱导特定基因表达，蛋白质的种类、数量或存在形式也因此发生变化，因此利用蛋白质组学研究他们的合成和变化模式是研究其代谢过程的一种非常有用的手段。

表2 热激蛋白的蛋白质组学研究Table 2 The researches of proteomics on heat shock proteins

4.1热激蛋白的表达蛋白质组学研究

表达蛋白质组学主要通过比较分析不同状态下或不同物种间蛋白质的表达图谱，实现对体系内代谢调控的动态监测，从而揭示有机体受到外界环境刺激时的反应途径以及细胞调控机制，并找出有意义的差异表达蛋白［49］。

植物抗逆的生理过程非常复杂，在逆境下会产生各种生理生化变化来响应逆境信号，但是抗逆机制仍不清楚。通过差异表达蛋白质组学技术可以在一定程度上解释这些逆境响应的分子机制，明确热激蛋白的表达类型及其在细胞内的理化性质、表达规律与生物学功能。

利用表达蛋白质组学，可以验证热激蛋白对增强植物的抗逆性有重要意义。在蛋白质组学的概念提出之初，何亚丽［50］对冷季型草坪草高羊茅(Festuca elata)热激后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳［51］，热激后的高羊茅能够合成几种高分子量热激蛋白，初步认为热激蛋白的合成是耐热性较弱的品种对热胁迫的响应方式。之后，林晓东等［44］对不同发育程度的玉米种子进行热激，结果显示热激诱导成熟度低的玉米种子胚大量合成HSP70s和smHSPs，成熟度高的玉米种子胚合成近20种热激蛋白，其中超过10种为smHSPs，证明热激蛋白与种子在发育中获得的自我修复和抗热能力有关。随着蛋白质组学的发展，其研究方法也日益成熟，通过双向电泳技术和质谱分析技术进行蛋白质组分析可以获得有关种子蛋白和基因的大量信息［52-54］。林争春［55］在对暖季型草坪草沟叶结缕草(Zoysia matrella)进行5、10、20、30和40℃不同温度梯度的处理后，利用双向电泳技术、质谱技术及生物信息学的方法，研究其蛋白质组的差异表达，结果表明共有27个蛋白质发生显著变化，其中包括参与细胞防御的热激蛋白;而且高温胁迫下热激蛋白表达量显著提高，这也解释了沟叶结缕草属于暖季型草坪草的分子机理。

将表达蛋白质组学在热激蛋白中的研究运用到作物的实际生产之中，能够增加作物的产量与质量，这也成为目前研究的一大热点。小麦受到高温胁迫时会产生一系列热激蛋白，不同发育阶段的热激蛋白存在差异，不同抗热作物品种中热激蛋白也存在差异。Song［56］利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质的分离，发现小麦在37和34℃诱导合成的新蛋白较多，并有相当数量的蛋白质含量上升，其含量的增加能够提高幼苗的抗热性，由此找到了诱导热激蛋白的合适品种和温度，为小麦的增产提供了一定的理论依据。高温已经成为水稻产量的主要限制因素，在蛋白质水平上研究高温胁迫下水稻基因的表达调控机制，可以更直接地找出与高温胁迫相关的基因群，揭示高温伤害和耐性机制。Han等［57］将水稻(Oryza sativa)幼苗叶片分别置于35、40和45℃的高温下48 h，进行蛋白质组学分析发现温度越高，水稻植株内形成的保护机制越多，而且热激蛋白在45℃下才被激活发挥作用;在此基础上，周伟辉等［58］对高温胁迫下的不同耐热性的水稻叶片进一步进行生长性状考察、生理指标测定与蛋白质组学研究，结果表明耐热品种中的热激蛋白表达量随温度升高而上升，与不耐热水稻的蛋白响应有明显差异，从而为水稻的耐热机制与高温下的实际生产提供了理论依据。

4.2热激蛋白的功能蛋白质组学研究

功能蛋白质组学介于传统蛋白质研究与蛋白质组研究之间，它高于对个别蛋白质的研究，但又不研究全部蛋白质;功能蛋白质组学把目标定位于蛋白质群体上，重点研究具有某种功能特点的蛋白质［59］。

功能蛋白质组学的研究只注重可能涉及到特定功能激励的蛋白质群体。在对逆境胁迫下的植物进行功能蛋白质组学研究时，则只关注与抗逆性相关的蛋白质，以此来阐明热激蛋白的作用机制。

目前对热激蛋白功能蛋白组学研究仍处于发展阶段，在水稻中的研究相对较多。为了阐明水稻热激蛋白质的作用机理，王勇斐［60］利用水稻蛋白质组和基因芯片，综合序列同源性及其与热应答基因间的相关性信息，从水稻蛋白质组中鉴定出了27个热激蛋白，对其中的HSP70s进行功能分析，在HSP70s正相关互作蛋白质中挖掘除了显著富集的24个生物过程和5个分子功能的GO注释，在HSP70s负相关互作蛋白质中挖掘出了显著富集的23个生物过程和16个分子功能的GO注释，探究HSP70s在水稻应对逆境胁迫中的作用机理。

4.3热激蛋白的结构蛋白质组学研究

结构蛋白质组学是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体，建立其蛋白质或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。而关于热激蛋白在结构蛋白质组学上的研究较少，有待发展。

5 展望

在种子贮藏过程中，随着其活力和生活力逐渐下降，对环境因子愈加敏感，为了增强种子的耐贮性，减缓种子萌发能力的丧失，对种子活力的研究是一个重要课题。种子劣变是一个十分复杂的过程，对其机理的研究对于种质资源的保存工作具有重要的意义。之前对种子劣变的研究一般都是涉及灌浆期种子受到热激和劣变种子萌发时受到热激产生的生理生化变化，而对成熟干种子在贮藏期受到劣变引起的蛋白质变化的研究并不多。

近年来，对种子热激蛋白的研究主要集中在通过表达蛋白质组学分析其热激蛋白种类，利用基因克隆技术鉴定热激蛋白功能等方面。因此，利用蛋白质组学对贮藏期间的成熟干种子进行研究，分析热激蛋白的表达模式和数据，从而阐明与种子胁迫耐性和种子耐贮藏能力有关的蛋白成分，为进一步探索蛋白基因在种子中的功能打下基础。

对种子贮藏过程中受到热激影响而产生劣变所引起的相关蛋白质进行蛋白质组学的研究，来判断热激蛋白种类、含量的变化，从而找到不同温度下牧草种子热激蛋白的质与量的变化趋势。根据热激蛋白的变化趋势，可以分析牧草种子贮藏的极限温度、种子高温劣变下起到主导保护作用的热激蛋白的种类和热激蛋白能够发挥作用的高温范围，这能够为进一步了解种子劣变与热激蛋白之间的联系提供线索。

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(责任编辑 王芳)

Advances in heat shock proteins of seed

Chen Quan-zhu1，2，Mao Pei-sheng1
(1.Beijing Key Laboratory of Grassland Science，College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China; 2.Chengdu Municipal Development and Reform Commission，Chengdu 610093，China)

A large number of proteins containing heat shock proteins (HSPs) can be synthesized in the process of maturation，storage and germination in plant seed.The correlation between HSPs and maturation or thermo tolerance of seed is revealed by studying the structure and function of HSPs so as to interpret the role of HSPs in seed.Seed vigour could be improved and the germplasm resources could be protected by cultivating plant seed with heatresistance.The purpose of promoting agricultural economic development will be achieved by means of realizing the high and stable yield in seed production.This paper summarizes the synthesis，classification，characteristics and function of HSPs.Furthermore，the roles of HSPs during the plant maturity，storage or germination are described in detail，and some researches of proteomics on HSPs are summarized.The applied progress utilized the proteomics to analysis the synthesis type and numbers of HSPs is provided during forage seed deterioration.

heat shock proteins; plant seed; proteomics

Mao Pei-sheng E-mail: maops@ cau.edu.cn

S351.1

A

1001-0629(2016) 1-0136-08*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0148

陈泉竹，毛培胜.种子热激蛋白研究进展.草业科学，2016，33(1) : 136-143.

Chen Q Z，Mao P S.Advances in heat shock proteins of seed.Pratacultural Science，2016，33(1) : 136-143.

2015-03-17 接受日期: 2015-05-05

现代牧草产业技术体系(CARS-35) ;北京市科技计划课题(D131100000413002)

陈泉竹(1991-)，女，湖北宜昌人，在读硕士生，主要从事牧草种子科学研究。E-mail: chen.quanzhu@ hotmail.com

毛培胜(1970-)，男，内蒙古锡盟人，教授，博士，主要从事牧草种子科学研究。E-mail: maops@ cau.edu.cn

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动物生产层