金钗石斛保健酒增强机体免疫力的筛选研究

赵明德，肖顺汉，孙　琴，罗　颖，覃雪峰，刘明华(.西南医科大学实验动物中心，四川泸州646000；.西南医科大学药学院，四川泸州646000)



金钗石斛保健酒增强机体免疫力的筛选研究

赵明德1，肖顺汉2，孙琴2，罗颖2，覃雪峰2，刘明华2
(1.西南医科大学实验动物中心，四川泸州646000；2.西南医科大学药学院，四川泸州646000)

摘要：优选金钗石斛保健酒的最佳制备工艺，筛选增强机体免疫力的最佳配制样品。以3种制备工艺配制金钗石斛酒样品A、B、C，考察收膏率、指标成分含量和感官3个指标，优选其最佳制备工艺。通过测定小鼠体重、免疫器官重量和血清溶血素，筛选增强机体免疫力的最佳配制样品。结果表明，3种方法制得的A、B和C保健酒收膏率分别为32.3 %、34.4 %和32.1 %，石斛碱含量分别为0.018 mg/mL、0.069 mg/mL和0.076 mg/mL，总皂苷含量分别为0.39 mg/mL、0.33 mg/mL和0.23 mg/mL。样品A、B、C低剂量(1.16 g生药/kg)、高剂量(2.32 g生药/kg)组均能升高免疫器官脾与胸腺指数，提高血清溶血素水平，对小鼠的免疫功能具有显著的调节作用(P＜0.05)，其中以样品B作用最强(P＜0.01)。金钗石斛保健酒能增强机体免疫力，样品B为其最佳配制样品。

关键词：金钗石斛；保健酒；增强免疫力

金钗石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)植物金钗石斛(D.nobile Lindl.)的新鲜或干燥茎。《本草纲目》记载金钗石斛有“强阴益精、厚肠胃、壮筋骨、暖水胀、补肾益力、轻身延年”之功效，因其特殊的生存环境和卓越的滋补功效而名列“中华九大仙草”之首，具有极高的药用价值。金钗石斛中主要含有生物碱、酚类、多糖、黄酮、菲联、苄、芴酮等成分，对心脑血管、消化系统、呼吸系统和眼科等疾病有明显治疗作用，具有抗肿瘤、抗衰老、调节机体免疫力、抗疲劳、有效减轻肝损伤、抗白内障等多重功效[1-3]。人参被人们称为“百草之王”，现代研究表明，人参的药理作用极为广泛，涉及人体中枢神经、心血管、免疫和消化等系统以及机体合成代谢、性腺等方面[4-6]。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，具有增强机体免疫力，调节神经系统，提高机体造血功能、生殖功能，降血糖和血脂，保护肝脏，抗疲劳，抗肿瘤，抗氧化等多重功效[7]。龙眼肉是无患子科龙眼属龙眼Dimocarrus Longan Lour.的假种皮，又叫桂圆、益智，主要有抗应激、抗焦虑、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节内分泌及增强免疫力等作用[8]。因其具有较高的食疗和药用价值，自古有“南方人参”之称。大枣具有补虚益气、养血安神、健脾和胃等作用，对慢性肝炎、肝硬化、贫血、过敏性紫癜等病症有较好疗效；其中大枣中含有三萜类化合物及环磷酸腺苷，有较强的抗癌、抗过敏作用[9]。

本课题组在中医药理论指导下，以泸州地道药材金钗石斛为主，配伍用人参、枸杞、龙眼肉、大枣，采用现制备工艺调配成30 %vol养生保健酒。以功效成分为指标，优选出最佳金钗石斛原料和制备方法，按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)开展功能性实验研究，为开发调节免疫力保健酒提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料及仪器

动物：昆明种小白鼠，清洁级，18～22 g，雌雄各半，均由泸州医学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(川)2013—17，使用许可证号SCXK(川)2013—065。实验动物饲养于泸州医学院实验动物中心，室温：22～24℃，湿度：65 %～80 %。给药期间，动物分笼以全价颗粒饲养，自由饮水。

受试物和实验试剂：金钗石斛药材，采自贵州赤水红花村金钗石斛种植基地(经泸州医学院生药教研室税丕先教授鉴定)；人参、大枣、枸杞和龙眼药材均购自泸州百草堂中药饮片有限公司，石斛碱对照品购于中国食品药品检定研究院，纯度≥99.8 %，批号YPE7-L608；清香型粮食酒和浓香型粮食酒均由泸州老窖酒业有限公司提供。Amberlite-XAD-2大孔树脂；中性氧化铝；甲醇为色谱纯；高氯酸、乙醇、冰乙酸、甲酸为分析纯；实验用水均为双蒸水；香草醛溶液：称取5 g香草醛于100 mL容量瓶中，加冰乙酸溶解定容至刻度。绵羊红细胞(SRBC)，泸州卫生防疫站提供。豚鼠血清，泸州医学院药理教研室制备。

仪器设备：UV-1800型紫外可见分光光度计，河北润联机械设备有限公司；A2204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；低温高速离心机，上海基屹生物科技有限公司；恒温水浴锅，北京国华医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1制备工艺研究

(1)药材前处理、水提、浓缩：按一个组方用药量分别称取药材金钗石斛(干燥后)120 g、人参60 g、大枣100 g、枸杞100 g、龙眼100 g，金钗石斛、人参粉碎(过三号筛)，大枣去核，枸杞、龙眼捣烂，常温下加水浸泡2 h，分别以10倍、8倍、6倍水煎煮60 min、50 min、40 min，合并煎液，过滤，浓缩成1000 mL清膏(相当于0.48 g生药/mL)，备用。

(2)配制30 %vol保健酒

A法制备：取上述方法制得的清膏400 mL，加入30 %vol的清香型粮食酒，混合溶解，冷藏静置24 h，取上清液，加30 %vol清香型粮食酒稀释至1000 mL，得样品A。

B法制备：取上述方法制得的清膏400 mL，加入30 %vol的浓香型粮食酒，混合溶解，冷藏静置24 h，取上清液，加30 %vol浓香型粮食酒稀释至1000 mL，得样品B。

C法制备：取上述方法制得的清膏400 mL，冷冻干燥成干膏，加30 %vol清香型粮食酒，溶解，过滤，取滤液，加30 %vol清香型粮食酒稀释至1000 mL，得样品C。

1.2.2功效成分检测

1.2.2.1收膏率测定

(1)水提物收膏率测定：取上述清膏100 mL，冷冻干燥，得干膏，称定重量，按公式(1)计算，计算水提物收膏率。

式中：m干膏为干膏重量，V总为投入总药材所提取的清膏体积，V为干膏干燥前的清膏体积，m总为总药材投入量。

(2)保健酒收膏率测定：分别取A、B、C样品各100 mL,冷冻干燥，称定重量，按公式(1)计算，得A、B、C收膏率。

1.2.2.2含量指标

(1)石斛碱含量测定。分别吸取样品A、B、C各10 mL，冷冻干燥，用甲醇溶解，过滤。注入气相色谱中，色谱柱：DB-1毛细管柱(100 %二甲基聚硅氧烷)；初始温度为70℃；柱温箱：以10℃/min升温至250℃，保持5 min；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃；进样量0.2 μL；柱压90 kPa；尾吹40 mL/min，测定石斛碱含量。

(2)人参总皂苷含量测定。参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中人参总皂苷测定办法进行如下操作：取人参皂苷Re标准溶液(2.0 mg/mL)100 μL作标准液和保健酒A、B、C各1 mL为待测液，分别水浴挥干后用水溶解残渣，过层析柱(制作见附录一)，用70 %vol乙醇和水洗柱，收集70 %vol乙醇洗脱液，置水浴中挥干。加香草醛溶液显色反应，于560 nm波长下测定吸光度(A)，按公式(2)计算A、B、C保健酒中人参总皂苷含量。

式中：A待测液为待测酒吸光度；A标准液为标准液吸光度；m人参皂苷Re为标准管人参皂苷的质量；V标准品稀释体积为标准品稀释体积。

(3)感官指标：分别从样品色泽、性状、有无肉眼可见杂质和滋味气味色泽等方面评价样品A、B、C。

1.2.3增强机体免疫力的功效研究

(1)剂量和分组：参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)保健酒增强机体免疫力实验。将90只小鼠随机分为9组，每组10只，雌雄各半，分别为样品A、B、C高剂量组(HD-A、HD-B、HD-C)、低剂量组(LD-A、LDB、LD-C)，溶媒基酒组(BC)，阳性对照组(YC)，空白对照组(NC)。灌胃给药，每天1次，连续30 d，实验期间小鼠自由饮水、摄食，称量体重。各组给药如下：实验组A、B、C高剂量小鼠灌胃给予剂量为2.32 g生药/kg，低剂量小鼠灌胃给予剂量为1.16 g生药/kg，溶媒对照组小鼠灌胃给予30 %vol浓香型粮食酒0.2 mL/10 g，阳性对照组小鼠灌胃给予转移因子胶囊(0.1 mg/mL)0.2 mL/10 g，空白对照组小鼠灌胃给予生理盐水0.2 mL/10 g。

(2)对免疫器官重量的影响：小鼠连续灌胃30 d，每日1次，末次给药后1 h，称量小鼠体重，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称胸腺和脾重量，按公式(3)计算脾(胸腺)指数。

(3)血清溶血素形成的实验：分组和给药方法同上，给药3 d后每只小鼠腹腔注射剂量为5 %的绵羊红细胞0.5 mL进行免疫。连续给药7 d后，于末次给药30 min后，摘眼球取血，分离得血清。量取稀释200倍血清l mL，加入5 % SRBC和10 %补体各0.5 mL,混匀，置37℃恒温水浴箱中温浴30 min，取出放在冰水中冷却，离心，取上清液，于540 nm分光光度计下测吸光度(A)。以半数溶血值(HC50)表示溶血素水平，按公式(4)计算。

式中：HC50表示半数溶血值；A待测样品表示待测样品的吸光度值；ASRBC表示SRBC半数溶血时的吸光度值；n表示待测样品稀释倍数。

1.2.4统计学分析

计量资料用以(x±S)表示，采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析及组间两两比较，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著统计学意义。

2　结果与分析

2.1功效成分测定

测得水提物收膏率及3种保健酒收膏率、石斛碱含量和总皂苷含量见表1。

2.2对小鼠免疫器官重量的影响

各剂量组小鼠活泼，皮毛光滑，未见任何不良反应。阳性对照组和样品A、B、C高、低剂量组小鼠实验结束时体重增加较明显，与空白对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。与空白对照组比较，溶媒基酒组动物脾脏、胸腺脏器系数未见显著性差异。但阳性对照和样品A、B、C高、低剂量组均能提高小鼠的胸腺指数和脾指数，呈现一定的剂量依赖性，以样品B作用最明显，与空白对照组比较，P＜0.01，结果见表2。

2.3对小鼠血清溶血素形成的影响

结果显示，阳性对照组和样品A、B、C高、低剂量组均能促进小鼠溶血素抗体形成，以样品B作用最明显，与空白对照组比较，P＜0.01，结果见表3。

3　讨论

表1 水提物和保健酒收膏率和指标成分含量

表2 对小鼠免疫器官的影响( x±S)

金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.，又称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科石斛属多年生附生草本植物。《本草纲目》中记载，金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”等，是药用范围较广的名贵中药；又由于其花型奇特、花色艳丽，而具有较高的观赏价值。多糖类成分是石斛中具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的活性成分。此外，还发现凡达到传统标准“质重，嚼之粘牙，口甜，无渣者为优”的样品种类中多糖含量均高于30 %。可见，多糖是石斛中一种重要的有效成分。

表3 对小鼠血清溶血素形成的影响( x±S)

评价收膏率和指标性成分两项化学指标，水煎提取物和A、B、C 3种保健酒收膏率均较高，配制过程所损失的成分均不大，其中B损失量最少。石斛碱含量以B、C较高，人参总皂苷含量以A、B较高。3种方法所制保健酒从感官指标评价，均符合保健酒相关规定。然而单从以上化学指标和感官指标参数难以确定最佳工艺方法，还需进一步结合药理效应进行确定。

金钗石斛(D.nobile)多糖具有直接促进淋巴细胞有丝分裂的作用，从而增强机体的免疫能力。在本次研究中，临床上免疫力测定没有明确的生化指标，但可以从免疫器官脾、胸腺的状态反应。造血干细胞在脾和胸腺等免疫器官发育分化为各类型成熟的免疫细胞。正常情况下，免疫器官的分化程度与机体免疫力相一致[10]。根据保健食品功能学评价程序和检验方法，免疫调节功效研究的判定方法：在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应；对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果呈阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用[11]。在本实验条件下，样品A、B、C高、低剂量组均能升高脾指数与胸腺指数，提高血清溶血素水平，对小鼠的免疫功能具有显著的调节作用。但以样品B作用最强，为金钗石斛保健酒最佳配制样品。

参考文献：

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[9]郭盛，唐于平，段金廒.大枣的化学成分及药理作用研究进展[C]//全国第8届天然药物资源学术研讨会论文集.凯里：中国自然资源学会天然药物资源专业委员会，2008：553-560.

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[11]张勇.紫丁香苷的测定及其降血脂、增强免疫力的研究[D].长春：吉林大学，2004.

茅台新品悉数亮相泸州酒博会

本刊讯：据《糖酒快讯-白酒》报道，2016年3月18日，贵州茅台集团党委书记、总经理李保芳率领有多名集团高管在内的70多人庞大代表团赶赴泸州，参加19日开幕的中国（泸州）国际酒业博览会。业内人士发现，这是近年来，贵州茅台集团派出的规模最大、规格最高的参会队伍。

由于本届泸州酒博会专门设置了“中国名酒馆”，为国酒茅台、泸州老窖、五粮液等17个中国著名品牌提供专属展区。所以此次茅台集团核心企业的茅台酒股份公司现有主打产品及新研发产品将悉数亮相，包括技术开发有限公司、保健酒公司、习酒公司、生态农业公司等在内的其他酒类子公司的产品也将集体登场。为此，除组委会免费提供的近200平方米面积的主展馆，茅台集团还在茅台主展馆旁边的一块空地上增加约为80平方米的场地用于集团子公司展示产品。（江源荐，骆佳龙编辑）

来源：糖酒快讯-白酒2016-03-18

Screening of Dendrobium nobile Healthcare Wine with Immunity-Enhancing Capability

ZHAO Mingde1, XIAO Shunhan2, SUN Qin2, LUO Yin2, QIN Xuefeng2and LIU Minghua2
( 1. Experimental Animal Center, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000; 2. School of Pharmacy, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China)

Abstract:In this study, Dendrobium nobile healthcare wine samples A, B and C were prepared by three different preparation technology respectively, and the best preparation technology was selected through the analysis of three indexes of wine samples (ointment collecting rate, index component content, and sensory indexes). Furthermore, the best wine sample with immunity-enhancing capability was screened out through the measurement of rat weight, immune organs weight, and serum hemolysin. The results showed that, ointment collecting rates of wine samples A, B and C produced by the three different technology were 32.3 %, 34.4 % and 32.1 % respectively, dendrobium content were 0.018 mg/mL, 0.069 mg/mL and 0.076 mg/mL respectively, and total saponins content were 0.39 mg/mL, 0.33 mg/mL and 0.23 mg/mL respectively. Both lowdosage group and high-dosage group of wine samples A, B and C could increase the immune organ spleen and thymus index, increase serum hemolysin level, and regulate the immune function of mice(P＜0.05). Among them, wine sample B had the best immunity-enhancing capability (P＜0.01) and it was the best wine sample.

Key words:Dendrobium nobile；healthcare wine；immunity-enhancing

通讯作者：刘明华（1972-），男，硕士，教授，硕士研究生导师，研究方向：抗肿瘤药物筛选及分子靶点研究，E-mail：liumhvip@163.com。

作者简介：赵明德（1966-），男，副研究员，研究方向：实验动物学，E-mail：99053808@qq.com。

收稿日期：2015-12-17

基金项目：泸州市-四川医科大学联合基金项目（No：2013LZLY-K74）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015469

中图分类号：TS262.91；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286(2016)04-0077-04

优先数字出版时间：2016-02-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160226.0948.003.html。