绵羊群体中不同布鲁氏菌病血清学诊断方法比较研究

杨秀芹，宋旭婷，徐　雪，陆明海，亓美玉，姚玉昌（.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨　5000；.黑龙江农垦科技职业学院动物科学系，哈尔滨　504；.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨　50086）



绵羊群体中不同布鲁氏菌病血清学诊断方法比较研究

杨秀芹1，宋旭婷1，徐雪1，陆明海2，亓美玉3，姚玉昌1
（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030；2.黑龙江农垦科技职业学院动物科学系，哈尔滨150431；3.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨150086）

摘要：布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属细菌（Brucella）引起的人畜共患传染病，在世界范围内广泛分布，造成重大经济损失和严重公共健康问题。利用菌体细胞或光滑型脂多糖（S-LPS）作抗原，检测待检动物血清中抗体血清学诊断方法，是布鲁氏菌病检疫主要手段。但目前尚无完美的单一检测方法用于动物布鲁氏菌检测。本研究针对RBT，SAT，iELISA和cELISA四种常用检测方法，在绵羊群体中（n=204），利用敏感性、特异性、Youden指数、AUC值等参数评估其准确性。应用单一方法检测时，iELISA敏感性最高（93.15%）；SAT特异性最高（98.47%）；iELISA的Youden指数和AUC值最大，分别达到88.75%和0.94。四种不同检测方法中，iELISA和cELISA之间符合率最高（87.25%），SAT和iELISA之间Kappa值最高（0.72）。两种方法组合作平行试验时，所有组合以SAT+iELISA的Youden指数值和AUC值最大，分别达到92.27%和0.96；系列试验时，RBT + iELISA的Youden指数值和AUC值最大，分别达到83.70%和0.92。研究结果将为布鲁氏菌病净化过程中检测组合的筛选提供参考，从而提高诊断准确性。

关键词：布鲁氏菌病；血清学诊断；绵羊

杨秀芹,宋旭婷,徐雪,等.绵羊群体中不同布鲁氏菌病血清学诊断方法比较研究[J].东北农业大学学报,2016,47(3):11-16.

Yang Xiuqin,Song Xuting,Xu Xue,et al.Comparision of different serological tests for diagnosis of Brucella infection in sheep[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):11-16.(in Chinese with English abstract)

布鲁氏菌病（Brucellosis），简称布病，由布鲁氏菌属细菌（Brucella）（一种革兰氏阴性、细胞内寄生菌）致人畜共患的传染病-变态反应性疾病，在世界范围内广泛分布，给畜牧业生产和人类健康带来极大威胁[1]。Assenga研究表明动物感染后呈急性或慢性症状，临床主要表现母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织（如睾丸、关节）炎症[2]。Galińska指出接触布鲁氏菌感染的病畜或畜产品（主要来自羊、牛和猪）可使人类患病，病期持续时间较长，需长时间抗生素治疗，严重可致残，丧失劳动能力[3]。Pappas研究表明该病在世界上160多个国家和地区流行，亚洲呈逐年上升趋势[4]。据国家卫生计生委疾病预防控制局统计数据显示，仅2014年，我国布鲁氏菌病人发病数为57 222人，其中死亡2人，与2013年同期相比发病率增加31.48%。

动物布鲁氏菌病确诊应分离病原体、鉴定种和生物型，但分离过程复杂，耗时长，且阳性检出率低[5]。同时，对生物安全防护措施等级和操作人员技术水平要求较高[6]。因此，布鲁氏菌病检疫最常用技术仍为血清学诊断方法，包括虎红平板凝集试验（Rose bengal test，RBT）、试管凝集试验（Serum agglutination test，SAT）、间接酶联免疫吸附试验（Indirect enzyme-linked immunosorbent assays，iELISA）、竞争酶联免疫吸附试验（Competitive enzyme-linked immunosorbent assays，cELISA）、补体结合试验（Complement fixation test，CFT）、乳牛全乳环状试验（Milk ring test，MRT）和荧光偏振试验（Fluorescence polarization assay，FPA）等。目前尚无单一血清学诊断方法同时兼顾高度的敏感性和特异性[7]，Minas等研究表明，RBT、CFT和cELISA敏感性只有75.80%、80.60%和76.50%[8]。ELISA和 FPA操作简单，检测快速、结果客观，但成本较高，难以大规模推广应用[9]。目前，布鲁氏菌病检疫过程中常采用RBT和SAT检测[10]，二者也是国家标准（GB/T 18646-2002）中规定的常规检测方法。因此，同时采用两种或两种以上新旧结合的诊断方法检疫、净化群体，可有效控制布鲁氏菌病流行。

本研究采用RBT、SAT、iELISA和cELISA四种血清学诊断方法检测绵羊布鲁氏菌病，应用系列和平行试验系统比对分析检测结果，以期为布鲁氏菌病检疫检测组合的筛选提供参考，提高诊断准确性。

1　材料与方法

1.1临床样品及试剂

于存在疫情的东北细毛羊群体中选择2～4岁个体204只，静脉采集血液，分离血清后-80℃保存待用。布鲁氏菌标准阴、阳性血清，RBT抗原购自中国兽医药品监察所（批号201503）；SAT抗原购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所（批号201505）；iELISA试剂盒和cELISA试剂盒购自国内厂家。

1.2 RBT检测操作流程

按动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准（GB/T 18646-2002）。将30 μL阴、阳及受检血清滴加至检测面板，取抗原30 μL，与血清混匀，出现凝集现象为阳性，反之为阴性。

1.3 SAT检测操作流程

准备100 μL受检血清、0.5%石炭酸的10%盐溶液，按动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准（GB/T 18646-2002），置于37～40℃温箱24 h，若终浓度为1ϑ25的血清稀释度出现++以上凝集反应为阳性，反之为阴性。

1.4 iELISA检测操作流程

将1ϑ50倍稀释的对照血清和受检血清100 μL加入包被好的96孔酶标板中，室温孵育30 min；4次洗板后加入100 μL辣根过氧化物酶标记的IgG，室温孵育30 min；4次洗板后加入含有一定量TMB和H2O2的底物溶液75 μL显色10 min，再加入75 μL的1 mol·L-1H2SO4终止酶继续反应，测定OD450 nm计算阳性百分比：阳性百分比（P%）=受检样品OD值×100/强阳性血清的平均OD值。

1.5 cELISA检测操作流程

将1ϑ10倍稀释的对照血清和受检血清50 μL加入包被好的96孔酶标板中，在反应的所有孔中加入单克隆抗体，室温振动孵育30 min；4次洗板后加入100 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，室温孵育30 min；4次洗板后加入含有一定量TMB和H2O2的底物溶液75 μL振动孵育显色10 min，再加入75 μL的1 mol·L-1H2SO4终止酶继续反应，测定OD450 nm计算抑制百分比：抑制百分比（I%）=100-受检样品OD值×100/样本稀释液平均OD值。

1.6临床样品检测与结果分析

对所有血清样品采用RBT、SAT、iELISA和cELISA方法血清学检测，至少两种方法同时鉴定呈阳性判定羊只患病，作为阳性参照。计算各诊断方法的敏感性（Diagnostic sensitivity，DSn）、特异性（Diagnostic specificity，DSp）、Youden's J值、阳性似然比（Positive likelihood ratio，+LR）、阴性似然比（Negative likelihood ratio，-LR）及曲线下面积（Area under curve，AUC）等。根据符合率和kappa分析评估不同检测方法符合情况，利用McNemar方法评估各检测方法间差异。利用SPSS 18.0软件相关模块作Receiver operator characteristics（ROC）曲线、kappa分析、McNemar分析。

2　结果与分析

2.1不同检测方法的基本数据

利用RBT、SAT、iELISA和cELISA四种方法同时对204份血清样品检测，见表1。单种检测方法中，在不考虑阳性参照情况下，RBT检出的阳性率最高，接近40%，其次为iELISA检验，SAT检出的阳性率最低。所有组合中，以RBT+iELISA组合检出的阳性率最高（29.90%）。在考虑阳性参照情况下，即以至少两种方法同时呈阳性结果则判定羊只患病，得到实际发病率为35.78%（95%CI：29.29%～42.82%）。所有检测样品中，22.06%（45/ 204）的个体在四种检测方法中均呈阳性，49.02% （100/204）个体在四种检测方法中均呈阴性。

表1　不同血清学检测方法的阳性、阴性结果Table 1 Number of sera with positive and negative results in different serological tests

2.2四种不同检测方法的基本评价

四种检测方法的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值见表2，图1。可知iELISA敏感性最高（93.15%）；SAT特异性最高（98.47%）。以iELISA 的Youden指数和AUC值最大，分别达88.75%和0.94。四种检测方法的阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比、阴性似然比见表3。

2.3不同检测方法之间符合情况

四种检测方法之间符合情况见表4。以iELISA 和cELISA之间符合率最高（87.25%），RBT和cELISA之间符合率最低（79.90%）。Kappa值以SAT 和iELISA之间最高（0.72），RBT和iELISA间最低（0.57）。经McNemar检验，RBT和SAT间差异极显著（P<0.01），SAT和iELISA间，SAT和cELISA间差异显著（P<0.05），其他比较差异不显著（P>0.05）。

2.4平行试验和系列试验下两种不同检测方法组合结果

平行试验和系列试验状态下，不同检测组合敏感性、特异性、Youden指数和AUC值见表5。由表5可知，进行平行试验时，所有组合中以SAT+iELISA的Youden指数值和AUC值最大，分别达到92.27%和0.96；进行系列试验时，所有组合中以RBT+iELISA的Youden指数值和AUC值最大，分别达到83.70%和0.92。所有组合中以SAT+iELISA平行试验时Youden指数值和AUC值最大。

表2　不同血清学检测方法的敏感性、特异性、Youden指数及AUC值结果Table 2　 Results of diagnostic sensitivity,diagnostic specificity,Youden's J value and AUC for different serological tests

图1　不同血清学检测方法的ROC分析曲线Fig.1 ROC analysis curves for different serological tests

表3　不同血清学检测方法的阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比、阴性似然比结果Table 3　 Results of positive predictive value,negative predictive value，+LR,and -LR of different serological tests

表4　不同检测方法之间符合情况比较Table 4　 Comparison of agreement of results for different serological tests

表5　平行试验和系列试验状态下两种不同血清学检测方法组合结果Table 5 Results of parallel and serial combinations of two different serological tests

3　讨论

动物布鲁氏菌病临床诊断复杂，通过分离病原体确诊患病羊检出率低，对生物安全防护措施等级和操作人员技术水平要求较高，不适于生产中大规模监测。目前，利用菌体细胞或光滑型脂多糖（S-LPS）作抗原，检测待检动物血清中抗体的血清学诊断方法，为布鲁氏菌病检疫的主要手段。其中，RBT、SAT、iELISA和cELISA四种血清学诊断方法操作相对简单，均为生产中常用的布鲁氏菌病诊断方法。研究人员建立并优化布鲁氏菌病的检测方法，Hari等优化的牛种布鲁氏菌病Super agglutination检测方法，与RBT、ELISA以及CFT相比较特异性和敏感性均有提高，该种方法是一个感染简单，准确和经济的筛选试验[11]；Ahmed等以小鼠为模型，建立B.melitensis rOMPs （rOMP25，rOMP28和rOMP31）iELISA方法，特异性和敏感性均可达到99%以上[12]。但目前血清学诊断技术均存在一定假阳性率和假阴性率，因此同时采用两种或两种以上诊断方法检疫和净化尤为必要。

本研究在相同饲养条件、品种的随机自然感染群体中，以至少两种检验方法同时鉴定为阳性结果作患病羊只判定标准[13-14]，得到实际发病率为35.78%（95%置信区间：29.29%～42.82%）。

RBT方法敏感性和特异性均不高，Blasco也认为其不适于临床患病个体确诊[15]。但RBT具有操作简单、价格低廉等优势，仍可作为群体筛选的推荐方法，与其他技术方法结合使用。SAT方法主要针对血清中IgM抗体检测敏感性最低，但特异性最高，Youden指数和AUC值最低。iELISA敏感性和特异性较好，Youden指数和AUC值最大，分别达到88.75%和0.94。cELISA的敏感性和特异性介于其他组之间。王淑云等比较5种检测人布鲁氏菌病的血清学方法（SAT、RBPT、PAT、ELISA和GICA法）特异性和敏感性，结果表明ELISA在诊断人布鲁菌病中特异性和敏感性较高，分别达到86.0%和94.8%[16]。

不同检测方法间，iELISA和cELISA一致性最好，符合率和Kappa值分别达到87.25%和0.72；RBT和cELISA一致性最差，符合率和Kappa值分别为79.90%和0.57。因此，各种检测方法存在明显检测盲区，在检疫、净化过程使用两种或两种以上检测方法交叉互补，既可减少因误杀造成的经济损失，又可降低因漏检造成布鲁氏菌病流行风险。

本研究中，利用两种检测方法作平行试验（两种诊断方法中任一种方法鉴定为阳性时即判定为患病个体）时，所有组合的敏感性（DSn）均大于95%，RBT+iELISA的敏感性最高（99.34%）；综合考虑特异性（DSp），SAT+iELISA组合的Youden指数和AUC值最大，分别达到92.27%和0.96。系列试验（两种诊断方法同时鉴定为阳性时则判定为患病个体）中，所有组合特异性均超过99%，其中SAT+ iELISA和SAT+cELISA组合特异性最好，综合考虑敏感性，RBT+iELISA组合的Youden指数和AUC值最大，分别为83.70%和0.92。Minas等研究绵羊和山羊群体时表明，平行试验策略下敏感性均大于94%，系列试验策略下特异性均大于99%，显著优于单一检测方法[8]。在非疫区或患病率很低的群体内，目标为常规监测疫病流行情况时，可选用系列试验策略下特异性较好组合，如RBT+iELISA方式；而在疫区或患病率较高的群体内，目标为快速净化群体时，应选用平行试验策略下敏感性较好组合，如SAT+ iELISA方式[8]。

因此，针对于不同检测目标，适当的检测策略（平行试验或系列试验），可有效提高布鲁氏菌病临床诊断准确性，对控制布鲁氏菌病流行，减少畜牧业经济损失，降低人感染疫病风险具有重要意义。

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Comparision of different serological tests for diagnosis of Brucella infection in sheep

YANG Xiuqin1,SONG Xuting1,XU Xue1,LU Minghai2,QI Meiyu3,YAO Yuchang1(1.School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Department of Animal Science,Heilongjiang State Farm Science Technology Vocational College,Harbin 150431,China; 3.Institute of Animal Husbandry,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Abstract:Brucellosis,a bacterial disease caused by various types of Brucella spp.,cause economic loss and public health problem and had a worldwide distribution.The diagnosis of Brucella spp.infection in animals mainly depended on serological tests using bacterial cells or smooth lipopolysaccharide(S-LPS)as antigens to detect antibodies in serum.Until now,there has been no perfect individual test to diagnose Brucella spp.infection in animals.In a sheep group(n=204),the accuracies of RBT,SAT,iELISA and cELISA were assessed with DSn,DSp,Youden's J value,AUC values etc.According to single test,the highest DSn,93.15%,was observed using iELISA,and the highest DSp,book=12,ebook=1798.47%,was observed using SAT.The iELISA appears to showed a higher Youden's J value(88.75%)and AUC value(0.94)than the other tests.The highest agreement rate(87.25%)was observed between iELISA and cELISA,and the highest kappa value(0.72)were observed by between SAT and iELISA.When the existing tests were used in parallel for any combination,the highest Youden's J value(92.27%)and AUC value(0.96)was observed by using combinations of SAT with iELISA.When the tests were combined in serial,the highest Youden's J value(83.70%)and AUC value(0.92)was observed using combinations of RBT with iELISA.This study would help to select adaptive combination of different tests,and to improve identification and diagnosis of infected animals in brucellosis eradication programs.

Key words:Brucellosis; serological tests; sheep

作者简介：杨秀芹（1971-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为动物抗病育种。E-mail:xiuqin163@163.com

基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项课题（2014ZX08008- 005）

收稿日期：2015-12-19

中图分类号：S852.614；R446.61

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）03-0011-06