荧光PCR法检测妊娠孕晚期妇女B族链球菌感染的应用价值

马勇?李莉

【摘要】 目的 通过几种方法对比检测B族链球菌（GBS）， 探讨荧光PCR法在产前筛查B族链球菌感染检测中的临床应用价值和意义。方法 采集临床孕35～37周孕妇的阴道和直肠分泌物标本480例， 用荧光PCR法、细菌培养法及基因测序法同时检测GBS， 并对结果进行分析。结果 荧光PCR法检测GBS阳性75例， 阳性率为15.6%；细菌培养法检测GBS阳性40例， 阳性率为8.3%， 两种方法检测阳性率比较差异有统计学意义（P<0.01）。荧光PCR法与基因测序法检测结果对比， 荧光PCR法检测GBS正确率为93.3%（70/75）， 灵敏度为100.0%（70/70）， 特异性为98.8%（405/410）。结论 荧光PCR法检测GBS明显优于细菌培养法， 与金标准基因测序法比对， 其检测准确率、灵敏度、特异性都较高， 是产前筛查GBS的最佳方法， 值得临床推广应用。

【关键词】 B族链球菌；荧光PCR法；细菌培养；基因测序

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.10.062

B族链球菌（GBS）学名无乳链球菌（S.agalactiac）， 正常寄居于生殖道和直肠， 是一种条件致病菌。在美国25%～40%的孕妇产道携带GBS， 其中有一半会传染给新生儿， 已被证实为围生期妇女及新生儿感染的主要致病菌之一[1]。在我国GBS的产前筛查也越来越受到重视。本文主要探讨荧光PCR法检测GBS的临床应用， 并与细菌培养法， 基因测序法进行比对。对比观察荧光PCR法检测的阳性率、准确率、灵敏度和特异性。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 收集本院2014年1～12月收治的孕周35～37周孕晚期的门诊和住院孕妇阴道和直肠分泌物标本480例， 孕妇年龄18～41岁。

1. 2 标本采集 标本采集部位和方法阴道口上1/3处， 沿生殖道壁用无菌拭子轻轻旋转取得分泌物；无菌拭子插入肛门括约肌上2～5 cm处， 沿直肠壁轻轻旋转取得分泌物。将采集好的拭子放回无菌试管内， 密闭送检。48 h内进行GBS的检测。

1. 3 仪器和试剂

1. 3. 1 美国ABI7500 RESL-TIME PCR分析仪。

1. 3. 2 福建泰普生物科学有限公司， B族链球菌核酸检测试剂盒[国食药管械（准）字2001第3400250号]。

1. 3. 3 郑州安图生物有限公司生产的微生物培养基和生化微量反应管。

1. 3. 4 长沙长锦科技有限公司， ST-2000A型CO2培养箱。

1. 4 方法

1. 4. 1 荧光PCR检测 标本处理：无菌拭子管中加入清洗缓冲液1 ml， 高速震荡2 min， 挤干拭子， 标本悬液移至试管中， 13000 r/min离心5 min， 弃掉上清液， 沉淀物中在加1 ml清洗缓冲液， 13000 r/min离心5 min， 弃掉上清液。沉淀物用100 μl 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）缓冲液重悬， 加入10 μl内参照。提取固型物：高速震荡5 min破碎细胞， 95℃干浴2 min， 冰浴5 min， 13000 r/min离心1 min， 上清液5 μl加入PCR反应管中， 进行PCR扩增检测（37℃， 2 min；95℃， 2 min；95℃， 15 s；55℃， 45 s；40个循环）。

1. 4. 2 细菌培养检测 将阴道和直肠分泌物标本接种在5%羊血培养基上， 分区划线， 置于35℃， 5%～10% CO2培养箱中。进行24 h培养后， 根据菌落形态， 溶血情况， 可疑菌落涂片染色， 显微镜下观察。在进行菌种鉴定试验：触酶试验、杆菌肽试验、溶血试验、CAMP试验、马尿酸钠水解试验、胆汁溶解试验、七叶苷试验等。

1. 4. 3 基因测序检测 标本中基因序列与编码CAMP蛋白序列比对， 均存在B族链球菌特有的基因序列为阳性。送第三方郑州金域医学检验中心检测。

1. 5 统计学方法 采用SPSS11.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 480例妊娠孕晚期妇女分泌物标本中荧光PCR法检测GBS阳性75例， 阳性率为15.6%；细菌培养法检测GBS阳性40例， 阳性率为8.3%， 两种方法检测GBS阳性率比较差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2. 2 以基因测序法作为GBS检测结果的金标准， 对荧光PCR法检测结果进行复查比对， 荧光PCR法检测GBS正确率为93.3%（70/75）， 灵敏度为100.0%（70/70）， 特异性为98.8% （405/410）。见表2。

3 讨论

最早 GBS的检测方法主要是传统的细菌培养法及细菌培养后菌落的胶乳凝集试验（LA）和协同凝集试验（COA）。根据菌落特点、溶血性、显微镜下形态观察及生化试验来判定GBS。但该方法耗时长， 细菌培养需24～48 h， 操作繁琐， 而且阴道和直肠的其他细菌生长抑制了GBS的繁殖， 培养难度高， 也不适合临床大量样本的筛查， 并且检测的阳性率也较低。本研究阳性率只有8.3%。国内同行有报道细菌培养法阳性率只有5.2%、7.5%[2， 3]。近些年来荧光PCR检测方法的普及， 利用不同种属GBS的特异性核酸序列设计引物， 用荧光探针标记， 使用先进的PCR检测仪， 可以实现快速（4 h内）、灵敏、高通量的GBS检测， 适合临床大规模样本的筛查。本文中荧光PCR检测阳性率达到15.6%。与国内一些学者报道荧光PCR法检出阳性率11.8%、9.4%都高于细菌培养法[4， 5]。与金标准基因测序法比对， 荧光PCR法检测GBS正确率为93.3%， 灵敏度为100%， 特异性为98.8%。与相关文献报道的正确率89.5%、灵敏度100.0%、特异性99.6%接近。另外， GBS标本取材后受保存条件、环境温度等因素的影响， GBS有部分死亡的可能， 而荧光PCR法可以检测到死亡的GBS。而GBS死亡， 则细菌培养法就会培养阴性。美国疾病预防控制中心（CDC）最新版的《妊娠合并B族链球菌（GBS）感染防治指南》指出有25%～40%的孕妇产道中携带GBS， 其中40%～70%在分娩过程中会传递给新生儿， 大约有1%～3%的新生儿会感染， 其中5%会导致死亡。孕妇感染GBS临床可表现出菌血症、泌尿系统感染、胎膜感染、子宫内膜感染及产褥期感染。GBS感染引起胎膜早破和羊膜腔感染， 诱发早产率可高达60%[6]。

综上所述， GBS对妊娠妇女危害严重， 因此及时进行产前筛查GBS显得尤为重要。荧光PCR法在GBS的检测上具有速度快、灵敏度高、特异性好、结果准确的特点， 显著优于传统的培养法， 且适用于大量人群的普筛及妊娠孕晚期妇女的产前筛查， 值得临床推广应用。

参考文献

[1] 时春艳， 曲首辉， 杨磊， 等.妊娠晚期孕妇B族链球菌带菌状况的检测及带菌对妊娠结局的影响.中华妇产科杂志， 2010， 45（1）：12-16.

[2] 刘睿， 崔坤友， 刘文彬， 等.应用荧光定量PCR技术和细菌培养法检测孕妇产前B族链球菌感染的对比分析.医学前沿， 2014（3）：198-199.

[3] 何国才， 白清， 李高， 等.桂林地区孕晚期孕妇B族链球菌检测及药敏分析. 国际检验医学杂志， 2013， 8（15）：2006-2007.

[4] 边佳明， 丁媛媛， 杨凡， 等.拭样增菌对实时荧光PCR法检测孕妇B族链球菌感染的影响.现代检验医学杂志， 2012， 1（6）： 102-103.

[5] 王丽， 叶巍， 马杰.实时荧光PCR技术和细菌培养法检测妊娠晚期孕妇定植B族链球菌感染临床分析.国际检验医学杂志， 2014， 8（16）：2220-2221.

[6] 李小梅， 李瑾， 袁敏智.用聚合酶链反应技术探讨B群链球菌与胎膜早破的关系.河北医学， 2011， 17（3）：300-302.

[收稿日期：2015-11-24]