枸杞多糖的提取及其抗衰老的研究

刘　杰，潘晓秋，周　晖，张海林，齐宏亮，廖　丹，倪雪松(中国医科大学附属第一医院鞍山医院药学部，辽宁 鞍山　114011)



枸杞多糖的提取及其抗衰老的研究

刘杰*，潘晓秋，周晖，张海林，齐宏亮，廖丹，倪雪松(中国医科大学附属第一医院鞍山医院药学部，辽宁 鞍山114011)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.03.029

摘要目的：优选枸杞多糖的最佳提取工艺，通过建立D-半乳糖致衰老小鼠模型，研究枸杞多糖的抗衰老作用。方法：采用正交设计法对提取工艺进行研究；应用D-半乳糖连续注射，造成实验性衰老小鼠模型，通过测定血液丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活力和皮肤中SOD、MDA及羟脯氨酸(Hyp)的水平来检测枸杞多糖抗衰老的能力。结果：通过正交设计确定的枸杞多糖的最佳提取方案为：料液比为1∶30，提取2次，1次90 min，功率为100 kHz。通过研究可见，枸杞多糖可提高小鼠血液中SOD、CAT、GSH-px水平，降低MDA值；可提高小鼠皮肤SOD活力，降低皮肤MDA含量，提高Hyp含量。结论：本研究建立的提取方法简单、易行，枸杞多糖的提出率高。枸杞多糖具有抗D-半乳糖所致小鼠衰老的作用。

关键词枸杞多糖； 提取； 抗衰老； D-半乳糖

Research on the Extraction and Anti-aging of Lycium Barbarum Polysaccharide

LIU Jie, PAN Xiaoqiu, ZHOU Hui, ZHANG Hailin, QI Hongliang, LIAO Dan, NI Xuesong (Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Anshan Hospital of China Medical University, Liaoning Anshan 114011, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To optimize the optimum extraction technology of lycium barbarum polysaccharide and establish senile mice model byD-galactose, so as to research the anti-aging effects of lycium barbarum polysaccharide. METHODS: Orthogonal design method was adopted to research the extraction technology. The senile mice model was established by injection ofD-galactose. The anti-aging capacibility of lycium barbarum polysaccharide were determined by the detection of malonaldehyde(MDA), glutathione peroxidase(GSH-PX), the content of catalase(CAT), activity of superoxide dismutase(SOD) and level of SOD, MDA and hydroxyproline(Hyp) in the skin. RESULTS: The optimum extraction technology scheme by orthogonal design method were: the ratio of solid to liquid was 1∶30, 2 times of extraction, 90 min for once, the power was 100 kHz. Lycium barbarum polysaccharide could increase the level of SOD, CAT and GSH-px in rats, decrease MDA, improve the SOD activity, decrease MDA and increase the content of Hyp in the skin of mice. CONCLUSIONS: The extraction method established by this research is simple and feasible, with high extraction rate of lycium barbarum polysaccharide. Meanwhile, lycium barbarum polysaccharide has significant effects on the senile mice model induced by injection ofD-galactose.

KEYWORDSLycium barbarum polysaccharide; Extraction; Anti-aging;D-galactose

枸杞子(Fructus Lycii)是茄科枸杞(Lycium barbarum L)成熟的果实，具有滋补肝肾，益精明目的功效。其主要化学成分为枸杞多糖、甜菜碱,现代医学主要用于增强免疫[1-2]，延缓衰老[3-4]，降低血糖[4-6]促进核酸和蛋白质合成并具有抗肿瘤[7-8]、抗氧化[9-10]、治疗心血管疾病等作用。考虑到枸杞多糖的食用性，本研究选择水做溶剂进行提取，探讨枸杞多糖抗衰老的作用，现报告如下。

1材料

1.1药品与试剂

枸杞(宁夏中宁县杞香源贸易有限公司)；苯酚、浓硫酸(分析纯)；D-半乳糖(北京拜尔迪生物技术有限公司)；无水葡萄糖(河北圣雪葡萄糖有限责任公司)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2动物

Wistar小鼠50只，购自大连医科大学动物中心。

1.3仪器与设备

UV2100 ultraviolet and visible spectrophotometer[USA UNICO (Shanghai) Instrument Co.Ltd]；Analytical balance FA2004(Shanghai Balance Instrument Plant)；PT1600E型组织匀浆机(浙江机械厂)；DL-4000B冷冻离心机(河南凯达科学仪器有限公司)。

2方法

2.1标准曲线的绘制

精密称取于105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.100 5 g加入到100 ml量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度[11]。分别精密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml置于100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，然后分别取1.0 ml置于具塞的试管中，分别加入5%的苯酚溶液1 ml，摇匀后加入浓硫酸5.0 ml，立即混匀后置于冷水浴中至室温。以蒸馏水为空白对照，在490 nm处检测吸光度值。以吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程为Y=11.653X+0.039 2，r=0.999 6(n=6)。

2.2枸杞多糖的提取及含量的测定

根据预实验，选择对超声水提工艺有影响的主要因素(溶剂用量、提取时间、超声功率、提取次数)按照四因素三水平进行L934正交试验[12]。各因素水平见表1。样品的测定方法同“2.1”项下，并按照下式计算枸杞中多糖的含量:多糖含量(%)=(C×Df/m)×100%(注：C=供试溶液中葡萄糖含量μg/ml；D=供试溶液的稀释倍数；f=换算因子；m=样品质量μg)。

2.3动物模型的制作及分组

60只Wistar小鼠平均体质量(25.00±1.00) g，雌雄各半，按随机数字表法分为正常组、模型衰老组、模型维生素E组、用药低剂量组、用药中剂量组、用药高剂量组，每组10只。正常组小鼠皮下注射1日100 mg/kg的0.9%氯化钠注射液，灌服0.9%氯化钠注射液1 ml/100 g·d；模型衰老组小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服0.9%氯化钠注射液1 ml/100 g·d；用药低剂量组小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服枸杞多糖水溶液10 mg/100g·d；用药中剂量组小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服枸杞多糖水溶液20 mg/100 g·d；用药高剂量组小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg·d，灌服枸杞多糖水溶液40 mg/100 g·d；模型维生素E组小鼠皮下注射D-半乳糖100 mg/kg·d，灌服枸维生素E溶液5 mg/100 g·d，连续30 d，灌胃和皮下注射均按照无菌操作进行的。

表1　超声水提工艺各影响因素分析

2.4指标检测

眼眶取血，分离血清备用，并处死动物，将脱毛背部皮肤取下，除去脂肪和结缔组织，称质量，以冰冷的0.9%氯化钠注射液冲洗，置于匀浆器中，用9倍的0.9%氯化钠注射液匀浆10 min，制备成10%的匀浆，然后4 000 r/min离心10 min，取上清液，备用。分别按照说明书的要求测试血清中的MDA含量、过氧化氢酶(CAT)、GSH-px的活性和红细胞中SOD活力，以及皮肤中MDA、SOD、Hyp的水平。

2.5统计学方法

3结果

3.1多糖提取及含量测定

直观分析和方差分析中可知各因素对枸杞多糖的提取工艺影响的主次顺序为料液比>提取时间>超声功率>提取次数。其中，料液比对提取工艺有显著性影响，差异有统计学意义(P<0.05)，根据实验结果可以确定枸杞多糖的最佳提取工艺为A3B3C3D2，即料液比为1∶30,提取2次，1次90 min，功率为100 kHz，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

3.2指标检测结果

3.2.1枸杞多糖对衰老模型小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSH-px活力的影响：与正常对照组比较，衰老模型组小鼠血液中SOD、CAT、GSH-px活力降低；用药组(包括用药低剂量组、用药中剂量组和用药高剂量组)和维生素E组可明显提高SOD、CAT及GSH-px的活力，且随着用药浓度的增加提高的活力增加的越明显。与正常对照组组比较，衰老模型组小鼠血液中MDA含量增高，用药组和维生素E组均可降低衰老组MDA的值，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表2　枸杞多糖的正交试验结果

表3　方差分析结果

3.2.2枸杞多糖对衰老模型小鼠皮肤SOD活力和MDA含量的影响：与正常对照组比较，衰老模型组小鼠皮肤SOD活力明显降低，用药组和维生素E组可明显提高皮肤SOD的活力。以正常对照组比较，衰老模型组小鼠皮肤MDA含量升高，用药组和维生素E均可降低MDA含量。与正常对照组比较，衰老模型组小鼠皮肤Hyp的含量显著较少，用药组和维生素E组均使含量提高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表5。

表4枸杞多糖对小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSH-px的

Tab 4Effects of lycium barbarum polysaccharide on SOD,

组别SOD/(U/mg)MDA/(nmol/mg)CAT/(U/mg)GSH-px/(mg/g)正常组(n=10)175.74±10.234.58±0.3525.18±1.62190.74±9.87模型衰老组(n=10)142.55±8.436.41±0.6218.64±1.34143.68±11.45模型维生素E(n=10)169.80±9.844.87±0.5122.37±1.48182.43±10.30用药低剂量组(n=10)151.36±11.275.74±0.4719.21±1.26150.72±8.62用药中剂量组(n=10)160.22±8.625.23±0.5321.59±1.07169.58±9.58用药高剂量组(n=10)168.93±7.204.98±0.4922.09±1.17175.87±8.63

Tab 5Effects of lycium barbarum polysaccharide on SOD,

组别SOD/(U/mg)MDA/(nmol/mg)Hyp/(mg/g)正常组(n=10)253.57±7.503.62±0.286.75±1.78模型衰老组(n=10)138.93±6.897.33±0.543.17±0.29模型维生素E(n=10)192.74±7.424.13±0.266.08±0.32用药低剂量组(n=10)145.62±6.276.03±0.374.57±0.47用药中剂量组(n=10)170.85±5.985.27±0.425.22±0.53用药高剂量组(n=10)190.23±6.034.58±0.355.92±0.44

4讨论

超声波提取法是利用超声波增大物质分子运动的频率和速度，增加溶剂的穿透力，提高物质溶出的速度，缩短提取时间，增大提取率。所以本实验就选择超声波提取，简单、快速、提出率高。

机体衰老后会出现SOD、CAT、GSH-PX的含量下降，体内自由基清除剂减少，体内的自由基增多，富集，引起不饱和脂肪酸氧化，形成大量的脂质过氧化物。SOD是体内清除自由基的中药物质，既能清除超氧阴离子自由基又能保护细胞免受损伤。GSH-px既能清除细胞内有害的过氧化 产物又能切断脂质过氧化连锁反应。Hyp是构成胶原蛋白和胶原纤维的主要成分，又是比较稳定的氨基酸，可稳定胶原蛋白的结构，从而修复受损皮肤组织。过氧化脂质是自由基损害作用的产物，可作为机体器官衰老的一个定量指标，而MDA是脂质过氧化物的终产物之一。本研究结果显示，衰老模型组小鼠细胞代谢紊乱，皮肤的SOD活性减低，MDA含量增多，Hyp含量减少，说明皮肤胶原蛋白减少，成纤维细胞排列疏松，皮肤弹性减弱，说明皮肤处于衰老状态。枸杞多糖可以使衰老模型组SOD、GSH-px、Hyp、CAT的含量提高，能降低MDA的含量，说明其通过提高机体自由基清除剂的活性，抑制自由基的长生，减少脂质过氧化反应，保护组织免受氧化剂和自由基的攻击，从而发挥抗衰老的作用[13]，具体机制有待研究。

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(收稿日期：2015-11-12)

中图分类号R93

文献标志码A

文章编号1672-2124(2016)03-0357-03

*主管药师。研究方向：临床药学。E-mail:wpf133@sohu.com