贺兰山野生酸枣黄酮含量及抗自由基活性的研究

杨安安，丁润梅（.宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川　750004；.宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川　750004）



贺兰山野生酸枣黄酮含量及抗自由基活性的研究

杨安安1，丁润梅2
（1.宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川750004；2.宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川750004）

摘要：以贺兰山野生酸枣为研究对象，采用索氏提取法以不同浓度的乙醇为溶剂提取总黄酮，并利用单因素试验优化提取贺兰山野生酸枣的工艺参数；采用DPPH法研究提取物的抗自由基活性。研究表明：贺兰山野生酸枣的最佳提取条件为乙醇浓度70 %，料液比1:30，提取时间6 h时，提取物中黄酮含量最高为0.490 %；提取物对DPPH自由基有较好的清除作用，清除率达81.66 %，证明贺兰山野生酸枣有一定的抗自由基活性。

关键词：贺兰山野生酸枣；总黄酮；DPPH法；清除自由基活性

酸枣别名山枣、野枣、棘等，鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物，酸枣是枣的原生种，在我国分布较广[1，2]，是盛产于我国北方的野生果树和野生药用植物资源。酸枣是我国35种贵重中药材之一，中医典籍《神农本草经》记载，酸枣“味酸平，主治心腹寒，热邪结气，四肢酸疼，湿痹，久服安五脏轻身延年”。研究表明，酸枣仁性味甘平，具有安神镇静作用，酸枣叶中可以提取到酸叶酮作为治疗冠心病的良药，酸枣根可以治疗失眠以及急性痢疾，酸枣树皮有止泻及防治皮肤烧伤、烫伤之功效[3]。近年来，英国学者在对虚弱症患者的观察中发现[4]，凡是连续按时吃酸枣的，其康复速度比单纯服用多种维生素类的快6倍以上，因此，酸枣被证明具有防病抗衰老与养颜益寿的作用。较多研究表明，黄酮类化合物是酸枣中普遍存在的多酚类物质，随着对其研究的深入，人们逐步发现黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静镇痛、免疫调节和抗肿瘤等作用[5]，同时，酸枣多酚酚羟基中的邻位酚极易被氧化，具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力[6，7]。

贺兰山野生酸枣生长在荒山野地，受有害物质污染少甚至无污染，具有色泽好、杂质少、药用物质含量高等特点，可以作为名贵药材。本文对贺兰山野生酸枣中总黄酮含量进行了测定，及对提取物抗自由基活性的研究，旨在为宁夏贺兰山地区野生酸枣资源的加工利用提供理论依据，对酸枣企业的发展和酸枣的深加工利用具有重要的指导意义。

1　材料与方法

1.1原料与仪器

1.1.1原料与试剂贺兰山野生酸枣；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）纯度为92.5 %；无水乙醇；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH（天津市科密欧化学试剂有限公司）分析纯；DPPH 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（Alfa aesar）纯度>95 %。

1.1.2主要仪器设备电热恒温鼓风干燥箱（101-4-S，上海跃进医疗器械厂）；紫外分光光度计（UV-1600，上海美谱达仪器有限公司）；KDM型调温电热套（山东省鄄城汇鑫科技有限公司）；万分之一电子分析天平（AEU-210，日本岛津）；索氏提取仪。

1.2试验方法

1.2.1芦丁标准曲线的绘制精密称取芦丁标准品10.0 mg，用60 %乙醇溶解，完全转入50 mL容量瓶中，用同浓度的乙醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准储备液。精密吸取上述芦丁标准储备液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，依次加入5 % NaNO21.25 mL，混匀放置5 min，加入10 % Al（NO3）31.25 mL，摇匀放置6 min，加入4 % NaOH 7.5 mL，再加60 %乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min后，用紫外分光光度计在510 nm波长处，以0 mL管为对照，测定吸光度值，每样平行三次测量，取平均值绘制标准曲线。

1.2.2黄酮含量的提取将酸枣洗净去核烘干，研磨粉碎，过40目筛，各称取5.0 g，置于索氏提取装置中，以乙醇为溶剂提取贺兰山野生酸枣中总黄酮。所得提取液减压蒸馏，除去多余的醇液，转入100 mL容量瓶中，以同浓度的乙醇定容，摇匀，提取3次，溶液待用。

在其他条件一致的情况下，采用单因素试验，考查乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素对总黄酮的提取效果。

1.2.3总黄酮含量的测定精密吸取4 mL样品提取液至25 mL容量瓶中，按照1.2.1中NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法操作，用同浓度乙醇定容至刻度，摇匀，用紫外分光光度计在510 nm波长处，以0 mL管为对照，测定吸光度值，根据线性回归方程计算黄酮浓度，按照相应稀释倍数计算出总黄酮的含量。计算公式如下：

其中：C-由标准曲线计算出的稀释后提取液中总黄酮浓度（mg/mL），6.25-稀释倍数，0.1-样品提取液体积（L），5-酸枣粉末质量（g）。

1.2.4样品提取液DPPH自由基清除率测定精密称取DPPH试剂25 mg，用无水乙醇溶解，定容于250 mL容量瓶中，配制成0.1 mg/mL DPPH标准溶液，避光保存。取2 mLDPPH标准液，加入无水乙醇，定容于25 mL容量瓶中，配制成DPPH工作液，避光保存。取2 mL DPPH工作液，加2 mL溶剂，在510 nm处测定其吸光度Dd。取2 mL DPPH工作液加2 mL样品提取液，在510 nm处测其吸光度Di。取2 mL样品提取液加2 mL溶剂，在510 nm处测其吸光度Dj。样品提取液对DPPH自由基清除率计算公式如下：

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线

以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得的回归方程为y=15.025x-0.015 8，R2=0.999 1，绘制的标准曲线（见图1）。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2贺兰山野生酸枣黄酮提取工艺

2.2.1浓度对贺兰山野生酸枣黄酮提取的影响选择不同浓度的溶剂按照1.2.2方法提取样品中总黄酮，在标准曲线中查出相应的值，样品中总黄酮含量以芦丁的相对量表示，通过1.2.3公式计算出贺兰山野生酸枣总黄酮含量（见表1）。

表1　浓度对黄酮含量的影响Tab.1 Effects of concentration of flavonoids content from wild jujube

结论：通过不同浓度醇回流对贺兰山野生酸枣中黄酮的提取试验结果发现，70 %醇回流得到黄酮含量最高，因此选择70 %醇作为提取溶剂。

2.2.2料液比对贺兰山野生酸枣黄酮提取的影响选择不同的料液比按照1.2.2方法提取样品中总黄酮，在标准曲线中查出相应的值，样品中总黄酮含量以芦丁的相对量表示，通过1.2.3公式计算出贺兰山野生酸枣总黄酮含量（见表2）。

表2　料液比对黄酮含量的影响Tab.2 Effects of solid-liquid ratio of flavonoids content from wild jujube

结论：通过不同料液比对贺兰山野生酸枣中黄酮的提取试验结果发现，料液比为1:30提取黄酮含量最高，故选择最佳的料液比为1:30。

2.2.3提取时间对贺兰山野生酸枣黄酮提取的影响选择不同的提取时间按照1.2.2方法提取样品中总黄酮，在标准曲线中查出相应的值，样品中总黄酮含量以芦丁的相对量表示，通过1.2.3公式计算出贺兰山野生酸枣总黄酮含量（见表3）。

表3　提取时间对黄酮含量的影响Tab.3 Effects of extraction time of flavonoids content from wild jujube

结论：通过不同提取时间对贺兰山野生酸枣中黄酮的提取，试验结果发现，随着提取时间的增长，所得黄酮含量越高，但增加到一定程度后，黄酮含量变化不大，为了节约时间，故选择最佳的提取时间为6 h。

2.3 DPPH自由基清除率

在最佳的条件下（溶剂：70 %醇、料液比：1：30、提取时间6 h）提取物，按照1.2.4方法做清除DPPH自由基能力的试验，平行测定三次（见表4）。

表4　贺兰山野生酸枣提取物对DPPH自由基清除率Tab.4 The extract in wild jujube on Helan mountain to remove DPPH free radical

3　结论

本实验采用溶剂浸提法以乙醇为浸提剂提取贺兰山野生酸枣中的总黄酮，并以芦丁为标准品，通过分光光度法在510 nm处测定提取液中黄酮的含量并在510 nm处测定其抗氧化活性。单因素试验表明，溶剂浸提法提取贺兰山野生酸枣中黄酮类物质的最优工艺条件为：提取剂70 %乙醇，提取时间6 h，料液比1：30，此时酸枣中黄酮类物质的含量为0.490 %。提取物对DPPH自由基有较好的清除作用，清除率达81.66 %，证明贺兰山野生酸枣有一定的抗自由基活性。

较多文献表明，通过对金丝小枣、赞皇大枣和阜平大枣中多酚物质的研究，可以证明其具有明显的抗氧化活性，具有十分广阔的开发前景。同时，黄酮的提取开发成本较高，从价格低廉的野生酸枣中提取黄酮成为当今研究的热点，对贺兰山野生酸枣中黄酮的提取、含量的测定以及对抗氧化活性的研究，可以为宁夏贺兰山地区野生酸枣资源的加工利用提供理论依据，对枣企业的发展和枣的深加工利用具有重要的指导意义。

参考文献：

［1］叶卉.酸枣中多酚类物质的提取分离及其活性的研究［D］.天津科技大学，2009.

［2］杨雷，周俊义，陈海江.酸枣资源研究进展及利用前景［A］.中国园艺学会干果分会、河南省新郑市政府.第三届全国干果生产与科研进展学术研讨会论文集［C］.中国园艺学会干果分会、河南省新郑市政府，2003.

［3］王建忠，等.酸枣仁中三萜皂苷的分离和结构研究［J］.有机化学，2008，28（1）：69-72.

［4］张泽生，等.酸枣皮中多酚类物质提取工艺及其抗氧化性研究［J］.食品研究与开发，2009，（11）：57-61.

［5］张艳军.花椒黄酮和多酚含量及抗氧化活性研究［D］.西北农林科技大学，2013.

［6］王和才，胡秋辉.DPPH法测定紫红薯提取物清除自由基的能力［J］.食品研究与开发，2010，（1）：132-135.

［7］刘红，等.不同提取方法对沙枣多酚清除自由基能力的比较研究［J］.食品科技，2010，（11）：227-230.

The extraction of flavonoid in wild jujube on Helan mountain and the determination of polyphenols anti-oxidational effects

YANG Anan1，DING Runmei2
（1.Clinical Medical School of Ningxia Medical University，Yinchuan Ningxia 750004，China；2.Basic Medical School of Ningxia Medical University，Yinchuan Ningxia 750004，China）

Abstract:Wild jujube on Helan mountain as the research object,by soxhlet extraction with different concentrations of ethanol as solvent extraction total flavonoids.And the use of single-factor test to optimize the extraction process parameters of Helan mountain wild jujube.The anti-free radical activity of the extracts was measured by using DPPH method.We found when the solid-liquid ratio was 1:30,the concentration of ethanol was 70 % and the extraction time was 6 h.The content of falconoid in the extract was 0.490 %.Extract on DPPH radical scavenging effect better, clearance rate 81.66 %,prove Helan mountain wild jujube have some anti-free radical activity.

Key words：wild jujube on Helan mountain；total flavonoids；DPPH method；anti-free radicals activity

通讯作者：丁润梅，女（1978-），硕士研究生，副教授，分析化学，邮箱：ding_rm@163.com。

基金项目：2015年自治区大学生创新训练计划，项目编号：NXCX2015187。

*收稿日期：2016－01-09

DOI:10.3969/j.issn.1673-5285.2016.03.033

中图分类号：R285

文献标识码：A

文章编号：1673-5285（2016）03-0127-04