响应面法优化超声波辅助提取冬虫夏草多糖工艺研究

◎ 刘忠宇，杜 静，王 瑜

（1.贵州省贞丰县市场监督检测所，贵州 贞丰 562200；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002)

随着分子生物学的发展，多糖多种多样的生物活性被揭示，且有些多糖已在功能食品及临床上广泛使用，这也使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、食品科学、生物化学及生命科举的研究热点[1]。冬虫夏草为麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，我国绝大多数学者和人们所指的冬虫夏草，是特指仅分布于我国青藏高原及边缘地区高寒草甸的中华虫草菌，寄生于蝙蝠蛾属、虫草蝙蝠蛾或绿蝙蝠蛾的幼虫，感病后形成的虫菌复合体其他类群仅称为虫草，不是地道的冬虫夏草[2]。其性平，味甘，具补肺益肾、止血化痰之功效，可增强机体对病毒及寄生虫的抵抗力[3]。多糖是冬虫夏草的主要活性成分之一[4]，具有抗肿瘤、增强机体免疫力和降血糖多方面药理作用。冬虫夏草主要含有冬虫夏草素、虫草酸、腺苷和多糖等成分，由于其天然虫草素含量较高，因此抗癌效果更为显著[5]；对人体的内分泌系统和神经系统有良好的调节作用；虫草酸能改变人体微循环，具有明显的降血脂和镇咳祛痰作用；虫草多糖是免疫调节剂，可增强机体对病毒及寄生虫的抵抗力[6]。由于多糖结构复杂，许久以来，人们对多糖的认识仅限于其是生物体内的能量资源和结构材料[7]，多糖的常用提取方法主要有水提法[8]、弱酸提取法、弱碱提取法、酶提法、超声辅助提取法[9]、微波辅助提取法及超临界流体萃取法等。超声波提取法是应用越声波强化摄取植物有效成分的方法[10]，是一种物理破碎过程。超声波是频率在20 kHz以上的声波，对煤质主要产生独特的空化作用[11]。与常规提取法相比，超声波提取有利于缩短时间，提高提取效率，所以超声提取在植物有效成分的提取中得到广泛应用[12]。实验采用超声波辅助法提取冬虫夏草多糖，设计响应面实验优化工艺参数，为冬虫夏草多糖的产业化开发提供一定的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

冬虫夏草样品，采自华东药业有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、95%乙醇和无水乙醇等化学试剂均为国产分析纯；试验用水均为蒸馏水。

1.2 实验仪器

101型电热鼓风干燥箱，北京市光明医药仪器厂；BS124S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；TDL8M台式低速冷冻离心机，长沙高新开发区湘仪贝克仪器仪表有限公司；中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 冬虫夏草多糖含量的测定

2.1.1 标准曲线的绘制

精密量取葡萄糖标准溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL和1.00 mL，分别置于具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，再分别加入5%苯酚1 mL，摇匀后，迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，各管加完后一起浸于水浴温度40 ℃的恒温水浴锅中，管口加盖玻璃球，以防挥发，加热15 min。取出，自来水冷却10 min，以蒸馏水的反应液体作为空白。用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，得出吸光度（A）对葡萄糖浓度（C）进行线性回归方程。

2.1.2 提取率测定方法

冬虫夏草样品经过75 ℃烘干后，用粉碎机粉碎过100目的筛子，制得冬虫夏草粉末，精确称取1 g粉末，按照一定的料液比，添加蒸馏水，在不同温度、不同功率的超声波条件下提取一段时间后，提取液经4 000 r/min离心10 min，取上清液作为多糖提取液。精密吸取样品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加硫酸5 mL，摇匀，放置15 min，于490 nm处测吸光度。根据吸光度（A）对葡萄糖浓度（C）线性回归方程计算多糖含量[13]。提取率的计算公式如下：

式（1）中，C为冬虫夏草多糖含量浓度，g/L；M为冬虫夏草粉末质量，g。

2.2 提取率影响因素单因素实验设计

2.2.1 冬虫夏草多糖提取超声波功率的选择

精确称取冬虫夏草粉末1 g，添加50 mL蒸馏水，提取温度设定为40 ℃，分别在功率120、150、180、240 W和300 W的超声波条件下提取20 min，然后提取液经4 000 r/min离心10 min，取上清液作为多糖提取液。精密吸取样品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加硫酸5 mL，摇匀，放置15 min，于490 nm处测定吸光度，根据公式计算提取率。

2.2.2 冬虫夏草多糖提取时间的选择

精确称取冬虫夏草粉末1 g，添加50 mL蒸馏水，提取温度设定为40 ℃，在功率300 W的超声波条件下提取15、20、25、30、35 min和40 min，然后提取液经4 000 r/min离心10 min，取上清液作为多糖提取液。精密吸取样品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加硫酸5 mL，摇匀，放置15 min，于490 nm处测定吸光度，根据公式计算提取率。

2.2.3 冬虫夏草多糖提取温度的选择

精确称取冬虫夏草粉末1 g，添加50 mL蒸馏水，提取温度分别为25、35、45、55 ℃和65 ℃，在超声波为功率300 W的条件下提取20 min。然后提取液经4 000 r/min离心10 min，取上清液作为多糖提取液。精密吸取样品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加硫酸5 mL，摇匀，放置15 min，于490 nm处测定吸光度，根据公式计算提取率。

2.2.4 冬虫夏草多糖提取料液比的选择

精确称取冬虫夏草粉末1 g，料液比为1/40、1/50、1/60、1/70和1/80，提取温度为40 ℃，超声波为功率300 W的条件下提取20 min。然后提取液经4 000 r/min离心10 min，取上清液作为多糖提取液。精密吸取样品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加硫酸5 mL，摇匀，放置15 min，于490 nm处测定吸光度，根据公式计算提取率。

2.3 响应面提取优化实验设计

为了进一步研究超声波功率、提取时间、提取温度、料液比对冬虫夏草多糖提取工艺的影响，考虑其交互作用并确定最佳工艺条参数，设计响应面优化实验，选取超声波功率、提取时间、提取温度、料液比为变量，提取率为响应值。对工艺参数进行优化，响应面设计因素水平表如表1所示。

表1 响应面试验设计因素水平表

3 结果与分析

3.1 葡萄糖标准曲线的制定

取浓度为10、20、30、40、60 g/L和80 g/L葡萄糖标准溶液绘制标准曲线如图1所示，横坐标为多葡萄糖水溶液的浓度C（g/L），纵坐标为吸光度值。对数据进行回归分析得到回归方程：

A=0.008 6C＋0.010 6，相关系数R2=0.998 8，则根据提取率计算公式可知：

式（2）中，A为吸光度；M为冬虫夏草粉末质量，g。

图1 葡萄糖标准曲线图

3.2 单因素实验结果分析

3.2.1 超声波功率对多糖提取率的影响

超声波功率对多糖提取率的影响结果见图2。

图2 超声波功率对多糖提取率的影响图

从图2可知，随着超声波功率的增加，冬虫夏草多糖的提取率逐渐增大，超声波功率达到240 W时，提取率达到最大值，以后随着超声功率的增加提取率变化较小。考虑到经济效益以及超声波功率过高使多糖降解，降低多糖活性等因素，因此选择超声波功率以240 W为宜。

3.2.2 提取时间对多糖提取率的影响

提取时间对多糖提取率的影响结果见图3。

图3 提取时间对多糖提取率的影响图

从图3可知，随着提取时间的不断增加，在15～30 min内，冬虫夏草多糖的提取率逐渐增大；当提取时间超过30 min时，在30～40 min内，多糖的提取率趋于平缓，略有下降。这可能是由于超声具有较强的机械切割作用，长时间的作用会破坏多糖，在后处理过程中损失增大而影响多糖的提出率，造成负面影响，表明提取时间不宜过长，控制在30 min左右为宜。

3.2.3 提取温度对多糖提取率的影响

提取温度对多糖提取率的影响结果见图4。

图4 提取温度对多糖提取率的影响图

从图4可知，随着提取温度的不断升高，在35 ℃时，冬虫夏草多糖的提取率达到最大值，当提取温度超过35 ℃时，35～45 ℃趋于平缓，然后随着温度的升高，多糖的提取率逐渐下降。这可能是由于较高的温度对冬虫夏草的活性多糖有破坏作用。另外，有研究表明温度过高会影响到冬虫夏草的药理活性，为了保证其活性不被破坏，应选择35 ℃作为冬虫夏草多糖适宜的提取温度。

3.2.4 料液比对多糖提取率的影响

料液比对多糖提取率的影响结果见图5。

图5 料液比对多糖提取率的影响图

从图5可知，料液比对冬虫夏草多糖的提取率影响不是很大，在料液比为1/50时，出现峰值，较其他料液比而言，提取率较大，随着料液比的不断增大，提取率略有下降。因此，选择1/50的料液比，作为冬虫夏草多糖的提取适宜料液比。

3.3 响应面优化提取工艺结果分析

3.3.1 响应面实验结果

在单因素实验的基础上，选取超声波功率X1、提取时间X2、提取温度X3、料液比X4为变量，提取率为响应值，进行相应面分析实验，实验结果见表2。

表2 响应面设计方案及实验结果表

响应面二次回归模型方差分析结果见表3。

表3 响应面二次回归模型方差分析表

由表3可知，回归模型显著，其中一次项超声波功率X1极显著，提取时间X2显著，提取温度X3和料液比X4不显著；X1X2极显著，X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4之间的交互作用不显著；二次项X21X22、X32、X42都是极显著的，因此各个具体试验因子与响应值都不是简单的线性关系。多糖提取率所建的回归模型P＜0.01是极显著的，并且该回归模型的R2=0.969 6，模型与实际试验失拟项P=0.050 8不显著，说明试验拟合较好，试验误差小，可用该回归方程代替试验真实点对冬虫夏草多糖提取率进行分析和预测。

3.3.2 响应面拟合方程的建立

采用Design-Expert8.0程序对表4.2 中所得数据进行回归分析，各因素经过回归拟合后，解得回归方程如下：

3.3.3 各因素交互作用对多糖提取率的影响

各因素交互作用对多糖提取率的影响结果分别见图 6～11。

图6 超声波功率和提取时间交互作用图

图7 超声波功率和提取温度交互作用图

图8 超声波功率和料液比交互作用图

图9 提取温度和提取时间交互作用图

图10 料液比和提取时间交互作用图

图11 料液比和提取温度交互作用图

由图6～11可知，超声波功率和提取时间对冬虫夏草多糖提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡；提取温度和超声波功率次之，表现为曲线稍为平滑，随其数值的增加或减少，响应值变化较小。通过软件分析，多糖提取的最佳条件为：超声波功率300 W，提取时间29.85 min，提取温度45.96 ℃，料液比1/49.94。在此条件下多糖提取率的理论值为14.52%。为了方便实际操作，将条件修正为超声波功率300 W，提取时间30 min，提取温度45 ℃，料液比为1/50。在此条件下测得多糖的提取率为13.48%，即与理论预测值的误差为1.04%，说明理论值与实际值基本相符，采用响应曲面法优化得到的超声波提取条件参数，具有一定的实用价值。

4 结论

本文在单因素实验的基础上，设计响应面优化实验对冬虫夏草多糖的超声辅助提取法进行优化，最终得出模型较好的回归方程：Y=+11.29-5.01X1-0.71X2+0.38X3+0.055X4-0.65X1X2+0.13X1X3+0.058X1X4+0.23X2X3+0.14X2X4-0.040X3X4-1.79X12-0.60X22-1.30X32-1.20X42。最终确定超声波辅助提取冬虫夏草多糖工艺参数为：超声波功率300 W，提取时间30 min，提取温度45 ℃，料液比1/50。在此参数下冬虫夏草多糖提取率最大。该工艺参数对冬虫夏草多糖的超声波提取具有一定的参考意义。

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