黄酮类化合物对沙门氏菌的体外抑制

◎ 李程野，杜继红，廖慧芬，富冠豪，李梓铭

（广东省食品药品职业技术学校，广东 广州 510663）

在各种的食物中毒中，沙门氏菌性食物中毒常居首位或第二位。沙门氏菌属（Salmonella）为肠杆菌科的一个属，广泛分布于土壤、水、动物粪便、动物体等环境中，可通过各种途径污染食品，如引起鱼、肉类、蛋类腐败，并使其表面变红和变黏，导致食物中毒，并引发人类的伤寒、副伤寒等沙门氏菌病[1]。

沙门氏菌性食物中毒一般认为是进食大量活菌（105～109CFU/g）和毒素的协同作用所造成。潜伏期很短，活菌进入肠道后繁殖，继而侵袭肠黏膜及肠黏膜下层，引起发炎，水肿，充血和出血，可造成菌血症和释放内毒素[2]。部分含VI抗原的细菌还能在吞噬细胞内繁殖，据认为VI抗原能防止细菌在细胞内的破坏。毒素包括内毒素和肠毒素。内毒素可引起发烧并增加消化道蠕动而发生呕吐和腹泻。由于蠕动加快，肠道内致病菌被迅速排出体外，患者在短期内多可恢复。肠道素能使细胞膜的腺苷酸环化酶活性增高，使细胞的氯离子分泌亢进和对离子吸收的抑制，从而引起小肠过度分泌水分和电解质，产生腹泻，因此认为肠毒素是导致腹泻的因素。

沙门氏菌除甲、乙、丙型伤寒杆菌仅对人类致病外，多种菌是动物和人类的共同致病菌；也有的对动物是致病菌，对人类是条件致病菌。由感染沙门氏菌引起的疾病统称沙门氏菌病，在人类主要为伤寒、副伤寒、食物中毒和败血症等[3]。潜伏期平均4～12 h，最短2 h，长者达2～5 d。起病急，体温可升高至38～40 ℃左右，伴呕吐、腹痛、腹泻（多为水样便）等症状[4]。病情轻重程度不一，有时可出现伤寒或霍乱样症状。一般病程短，预后较好，但严重者也可引起死亡。

黄酮类化合物（Flavonoid）是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。以C6-C3-C6为基本碳架，包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物。黄酮类化合物常应用于植物研究领域，在植物体内以苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基[5]。

近年来，国内外学者对类黄酮的研究集中在分离纯化、结构鉴定、清除自由基、药理作用、抗辐射作用、抗癌和抗肿瘤等方面。与此同时，类黄酮对微生物的抑制和杀灭作用使类黄酮的研究进入一个新的阶段。国内外对黄酮类化合物抑菌作用的研究，主要涉及抗菌能力的测定，具有抗菌能力的黄酮体种类和抑菌作用的构效关系等领域。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

（1）主要试验材料。槲皮素、芦丁、柚皮素三种黄酮类化合物，由广东省食品药品职业技术学校食品化妆品教研组提供；沙门氏菌（Salmonella），由广东省食品药品职业技术学校微生物实验室提供。

（2）培养基。①固体培养基。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高压灭菌30 min。②液体培养基。牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高压灭菌30 min。

（3）试验仪器。立式压力蒸汽灭菌器YM型，上海三申医疗器械有限公司；生化培养箱LRH-500型，上海一恒科技有限公司；双人净化工作台SW-CJ-2FD型，苏州净化设备有限公司；电子恒温水浴锅HH-S28S型，江苏金坛市大地自动化仪器厂；电子分析天平FA2204，上海上平仪器有限公司。试管、培养皿、吸管、酒精灯、接种环、三角瓶、烧杯、玻璃刮铲、1 000 mL刻度搪瓷杯、小铝锅、托盘天平、分装漏斗、漏斗架、纱布、棉塞、牛皮纸、橡皮圈、电炉。

1.2 试验方法

（1）沙门氏菌的培养。配制牛肉膏蛋白胨液体培养基100 mL，从沙门氏菌菌种斜面挑取一环于盛有20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，放入生化培养箱中，调节温度为37 ℃，培养24 h后，再转入4 ℃冰箱冷藏保存，备用。

（2）黄酮类化合物溶液的配制。分别称取100 mg槲皮素、芦丁、柚皮素，溶解于10 mL无水乙醇中，配制成浓度为10.000 mg/mL的原液，备用。

（3）不同黄酮类化合物抑菌效果测试。利用琼脂扩散法，取浓度为106CFU/mL的沙门氏菌菌悬液1 mL，加入100 mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，吸取15 mL置无菌平皿制备含菌牛肉膏蛋白胨琼脂平板，待凝固后，按梅花花瓣状将5只牛津杯放置于培养基平板表面，其中3杯分别加入浓度为10.000 mg/mL槲皮素、芦丁、柚皮素溶液，用无水乙醇作为阴性对照，用庆大霉素针剂作为阳性对照，每组分别设置3个平行试验。然后再将平皿置于37 ℃恒温箱中培养，24 h后取出观察[6]。用游标卡尺测量形成的抑菌圈直径并比较其抑菌效果。每种抑菌液的排列如图1所示。

图1 各种抑菌液的排列方式图

（4）不同黄酮类化合物最小抑菌浓度（MIC）的测定。配制不同浓度的黄酮类化合物，采用试管2倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。试验中每种制剂原液（10.000 mg/mL）均用牛肉膏蛋白胨培养基2倍系列稀释10个梯度，每组13支试管，各试管中加入牛肉膏蛋白胨培养基2.5 mL，在第1管内各加入槲皮素、芦丁、柚皮素2.5 mL，混匀后吸取2.5 mL到第2管，混匀后吸取2.5 mL到第3管，依次类推到第10管，每管黄酮类物质浓度见表1。第11支试管作阳性对照（庆大霉素），第12、13支管作阴性对照（生理盐水、无水乙醇）[7]。

表1 含不同浓度黄酮类化合物的液体试管培养基的配制表

每组试管中分别接种沙门氏杆菌菌悬液0.05 mL，并将上述试管置37 ℃恒温箱中培养24 h后，取出试管，充分震荡后根据其浑浊度，判断有无菌生长。如试管中培养液出现膜状物或混浊为“+”，无膜状物且澄清透明为“-”，表明沙门氏菌的生长被抑制[8]。若上述试管用难以肉眼判断其混浊度，则分别接种到对应编号的斜面培养基上，置于相应温度培养，观察沙门氏菌的生长情况[9]。导致沙门氏菌完全被抑制的最低黄酮类化合物浓度即为其对相应菌株的MIC[10]。

（5）不同黄酮类化合物最小杀菌浓度（MBC）的测定。取上述物最小抑菌浓度以上未见细菌生长的各管培养物，分别吸取100 μl，涂布接种在不含制剂的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上[11]，置37 ℃培养过夜，观察有无菌生长，计数少于5个菌落者即为该黄酮类化合物的最低杀菌浓度（MBC）。

2 结果与分析

2.1 不同黄酮类化合物对沙门氏菌的作用

利用琼脂扩散法对沙门氏菌的测定结果见表2。从表2可知，三种黄酮类化合物对沙门氏菌的抑菌效果各不相同，槲皮素对沙门氏菌的抑菌作用最强，芦丁对沙门氏菌的抑菌作用次之，柚皮素对沙门氏菌的抑菌作用最低。三种黄酮类化合物抑制沙门氏菌能力大小顺序为槲皮素＞芦丁＞柚皮素。

表2 黄酮类化合物抑制沙门氏菌活性表

2.2 不同黄酮类化合物对沙门氏菌的抑菌效果

不同浓度的黄酮类化合物对沙门氏菌的抑菌效果见表3。从表3可知，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中，三种黄酮类化合物对沙门氏菌具有不同程度的抑制作用，且各自随着浓度的增加，抑菌作用增强；其中槲皮素的抑菌效果最为明显；芦丁次之；与之相比柚皮素的抑菌浓度最高，需要在较高浓度才能完全抑制沙门氏菌的生长。

表3 不同浓度的黄酮类化合物对沙门氏菌的抑菌效果表

2.3 不同黄酮类化合物对沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）

黄酮类化合物的最小抑菌浓度见表4。由表4可知，三种黄酮类化合物对沙门氏菌均有不同程度的抑菌作用，柚皮素的最低抑菌浓度最高，其次是芦丁，槲皮素的抑菌浓度最低，即抑制沙门氏菌的作用最强。

表4 黄酮类化合物的最小抑菌浓度表

2.4 不同黄酮类化合物对沙门氏菌的杀菌效果

不同浓度的黄酮类化合物对沙门氏菌的杀菌效果见表5。由表5可知，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，三种黄酮类化合物对沙门氏菌具有不同程度的杀菌作用，且各自随着浓度的增加，杀菌作用增强。其中槲皮素的杀菌效果最为明显，芦丁和柚皮素杀菌效果次之。

表5 不同浓度的黄酮类化合物对沙门氏菌的杀菌效果表

2.5 不同黄酮类化合物对沙门氏菌的最低杀菌浓度（MBC）

黄酮类化合物的最低杀菌浓度见表6。由表6可知，三种黄酮类化合物对沙门氏菌能在较低的浓度下杀菌，柚皮素稍高，芦丁和槲皮素的杀菌浓度次之，且随着浓度的增加，杀菌作用越强。

表6 黄酮类化合物的最低杀菌浓度表

3 结语

从抑菌圈试验、最小抑菌浓度试验和最低杀菌试验可得出，柚皮素、芦丁、槲皮素三种黄酮类化合物，特别是槲皮素，能够在很低的浓度下抑制沙门氏菌的生长。总体抑菌效果上，三种黄酮类化合物抑制沙门氏菌能力大小顺序槲皮素＞芦丁＞柚皮素，且在浓度高时具有杀菌的作用，黄酮类化合物柚皮素、芦丁、槲皮素对沙门氏菌的最低杀菌浓度分别为0.063、0.125、0.125 mg/mL，且随着浓度的增加，杀菌作用越强。说明这三种黄酮类化合物柚皮素、芦丁、槲皮素具有开发利用价值。

目前，黄酮类化合物对微生物的抗菌活性的研究基本集中于体外试验。黄酮类化合物在人和动物体内，尤其是消化道内对微生物活性影响的研究极少，有待进一步深入研究[12]。

参考文献：

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[12]方从兵，宛晓春，江昌俊.黄酮类化合物生物合成的研究进展[J].安徽农业大学学报，2005（4）：498-504.