提取油茶籽抗氧化活性物质的研究

◎ 曾丽珠，李 轩，张 昊

（阳江出入境检验检疫局，广东 阳江 529500）

1 研究背景

1.1 油茶籽的应用价值

油茶（Camellia oleiferaAbel）隶属于山茶科（Theacese）山茶属（CamelliaL），是我国特有的食用油料树种，脂肪酸组成与在西方被誉为“液体黄金”的橄榄油相似，长期食用茶油，具有预防心脑血管疾病、抗肝炎、抗衰老、防癌抗癌等功效。而油茶籽油具有多种功效，归功于其含有多种功能性成分，如角鲨烯、茶多酚、山茶皂甙、山茶甙等活性物质[1]。

目前，国内外使用较多的是合成抗氧化剂，如没食子酸丙酯（PG）、二叔丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）或丁基羟基茴香醚（BTA）等[2]，但随着人们食品安全意识的提高，对合成添加剂的添加提出了质疑。从油茶籽中提取出高效安全低毒的抗氧化活性物质，成为进一步开发天然高效食品抗氧化剂的重要途径。

1.2 亚临界萃取技术的应用

传统的油茶籽油的提取工艺主要有压榨法、有机溶剂浸提法、水蒸气蒸馏法、油脂分离法等，新型的提取工艺则有超临界萃取法[3]和亚临界萃取，显然前几种的提取方法都会一定程度上影响茶油的成率和品质，超临界CO2提取茶籽油尽管产品质量好、得率高，但设备要求高，一次性资金投入较大。而亚临界萃取作为其中一种新型提取工艺，有着条件相对温和，对高压设备要求不苛刻和成本更低的优点。

1.3 研究的目的与意义

本文通过提取油茶籽中不同极性物质，对不同极性的萃取物质进行总酚含量的测定，并利用油茶籽油中不同极性萃取物进行自由基清除能力试验，初步探明不同极性酚类物质的抗氧化能力和清除自由基的效果，有利于有针对性地分离、提取活性物质。在发现油茶籽中含有中等极性的抗氧化活性成分的基础上，进一步研究亚临界茶油的抗氧化活性，从而为论证亚临界茶油的高品质奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

油茶籽；油茶籽醇提物：自制（油茶籽经挑选后热风干燥，用70%乙醇，在35 ℃下提取30 min，料液比1∶30，减压浓缩真空干燥，密闭、低温保存备用）；市售茶油、亚临界茶油，参数选择：原料堆密度0.7 kg/L，萃取时间70 min，萃取压力0.5 MPa，萃取温度45 ℃，颗粒度10目，亚临界丁烷；没食子酸（GA）标准品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；三氯乙酸。

鼓风干燥箱，旋转蒸发仪，真空泵，超声清洗器，、数显恒温水浴箱，棱光紫外分光光度计，中药粉碎机。

2.2 实验方法

（1）油茶籽醇提物的分级萃取。称取一定量的油茶籽醇提物，用水配制成悬浮液，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次。各不同极性的萃取液合并后用旋转蒸发仪减压浓缩至干粉，即得到分级萃取各相，分别为石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相及水分级相。

（2）油茶籽醇提物及其各分级萃取相的总酚含量测定。标准曲线的制定：准确称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成浓度为8.86、17.72、35.44、70.88 μg/mL和88.60 μg/mL的溶液。分别取上述不同溶液1 mL加到10 mL比色管中，依次加入1 mL去离子水，0.5 mL已稀释2倍的福林-酚试液，1.5 mL 26.7%Na2CO3溶液，最后用水定容至10 mL，室温下反应2 h，在760 nm下测定其吸光度。由吸光度对浓度进行回归分析，绘制标准曲线。试样的测定：准确称取适量试样，用水溶解，浓度在0.08 mg/mL左右。取1 mL样品液加到10 mL比色管中，测得的吸光度代入标准曲线，求得试样中总多酚的含量。

（3）清除DPPH自由基活性的测定。试样的测定：分别将各相萃取物提取液4 mL和2×10-4mol/L DPPH溶液1 mL加入同一具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置30 min，用纯溶剂甲醇作参比液，于517 nm波长下测定吸光度。根据公式（1）计算每种提取液对DPPH自由基的清除率。

其中，As为加4 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb为4 mL提取液+1 mL溶剂（甲醇）后的吸光度；Ac为4 mL溶剂（甲醇）+1 mLDPPH溶液的吸光度。

（4）还原能力的测定。在2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的试样液2.5 mL，1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒温20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min离心分离10 min，取上层清液5 mL加蒸馏水5 mL和0.1% FeC13溶液l mL，在700nm处测定吸光度，即为OD值。吸光度越高，还原能力越强。

3 结果与分析

3.1 油茶籽醇提物不同萃取层中总酚含量

以标准没食子酸浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归分析得标准回归方程为y=0.007 9x+0.045 6，线性相关系数R2=0.9961。利用没食子酸浓度与吸光值的关系标准曲线图，可根据吸光值推测定试样的没食子酸浓度。在碱性溶液中，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在760 nm处有最大吸收。一般用没食子酸（或焦性没食子酸）作为参照标准。提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸的量表示。

取各不同极性的干粉，配置成相同浓度，利用没食子酸标准曲线测定其中总酚含量，总酚含量大小依次为：正丁醇＞乙酸乙酯＞水层＞石油醚层。

3.2 油茶籽醇提取物不同萃取层清除DPPH自由基活性

相同浓度下，不同萃取层清除DPPH自由基活性的能力不同，自由基清除能力大小依次为：乙酸乙酯＞正丁醇＞水层＞石油醚层。在所测浓度内，乙酸乙酯层表现出较强的自由基清除能力。

3.3 油茶籽醇提取物不同萃取层还原能力

各萃取层样品反应后的生成物在700 nm下的吸光度大小，可反映出物质抗氧化能力的强弱。OD值由大到小依次为：乙酸乙酯＞正丁醇＞水层＞石油醚层。结合以上三点可知，油茶籽醇提取物中不同萃取层的还原能力、DPPH清除率与酚类含量呈正相关关系。

3.4 乙酸乙酯层柱层析后抗氧化活性比较

取乙酸乙酯层萃取物，过100～200目硅胶柱，以乙酸乙酯∶甲醇进行梯度洗脱，洗脱比例分别为：10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和5∶5（极性依次增加）。每个梯度洗脱3倍柱体积，分段收集，以自由基清除率和还原能力为评价指标进行检测。以自由基的清除率为比较指标得出：6∶4＞9∶1＞油茶籽醇提取物＞10∶0＞7∶3＞8∶2＞5∶5。以还原能力为比较指标：9∶1＞油茶籽醇提取物＞6∶4＞10∶0＞7∶3＞5∶5＞8∶2。结果进一步论证了油茶籽中抗氧化成分的存在及其极性大小。

3.5 亚临界茶油与市售茶油的自由基清除能力比较

市售茶油和亚临界茶油均有清除DPPH自由基的能力，且清除能力与样品的浓度呈现正相关关系，随着样品浓度的增大其清除能力也越大。但随着浓度的增加，亚临界茶油的自由基清除能力明显高于市售茶油，这可能与其含有较多的有效抗氧化成分有关。

4 结语

油茶籽中含有抗氧化活性成分。利用活性跟踪方法发现，对油茶籽醇提取物进行分级萃取，其活性较强的部分集中在乙酸乙酯层，过柱后活性部位主要富集在9∶1和6∶4，且初步研究得出亚临界茶油的自由基清除率优于市售精炼茶油。

参考文献：

[1]毛方华，王鸿飞，刘 飞等.茶籽油的提取及其对自由基清除作用的研究[J].西北林学院学报，2009（5）：125-128.

[2]董新荣，刘宇光，李本祥.芝麻酚对茶油抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2008（7）：19-21.

[3]李川山，陈 晔.植物精油提取工艺研究进展[J].大众科技，2010（9）：86-87.