Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在子宫内膜腺癌中的表达及意义

李李　周龙书　史文静



Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在子宫内膜腺癌中的表达及意义

李李周龙书史文静

【摘要】目的通过研究血管生成抑制蛋白Vasohibin-1、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在正常增殖期子宫内膜(normal endometrium，NE)、子宫内膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia，EAH)和子宫内膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)组织中的表达，探讨上述指标与血管内皮生长因子(vascular endometrial growth factor，VEGF)及EA临床病理特性的关系。方法采用免疫组织化学方法检测Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在15例NE、30例EAH和50例EA组织中的表达，分析各指标之间及与EA临床病理特性的关系。结果在EA组织中，Vasohibin-1、VEGF和HIF-1α的阳性表达率明显高于NE组(P＜0.05) ; VEGF和HIF-1α的表达阳性率与EA临床手术分期有关且随期别升高而升高(P＜0.05)，而Vasohibin-1与临床手术分期无关(P＞0.05) ;在EA组织中，Vasohibin-1、HIF-1α与VEGF的表达呈正相关(P＜0.01)，而Vasohibin-1与HIF-1α无相关性(P＞0.05)。结论Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α均在EA组织中高表达，Vasohibin-1在高水平的VEGF诱导下表达升高，但并不足以抑制EA组织中新生血管形成，可能存在其他旁路调节途径来调节两者之间的平衡。

【关键词】子宫内膜腺癌; Vasohibin-1; VEGF; HIF-1α

子宫内膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)是子宫内膜癌最常见的类型，占80%～90%，近年来该病发病率呈不断上升趋势，严重威胁女性的身体健康［1］。其中新生血管生成是大多数肿瘤形成的重要因素，而血管新生的调节则取决于血管生成因子与血管抑制因子的平衡。其关键因子是血管内皮细胞生长因子(vascular endometrial growth factor，VEGF)。最近研究发现VEGF的表达在基因水平上受转录因子缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的直接调控，而迄今为止发现的唯一可以通过负反馈调节VEGF进而发挥抗血管生成作用的调节蛋白为血管生成抑制蛋白Vasohibin-1［2］。本文通过研究Vasohibin-1、HIF-1α在正常增殖期子宫内膜(normal endometrium，NE)、子宫内膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia，EAH)和EA组织中的表达，从而探讨上述指标与VEGF及EA临床病理特性的关系，报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2009年5月至2014年5月我院EA石蜡包埋标本50例作为EA组。患者年龄24～80岁，中位年龄54岁。术前均未经放、化疗或激素治疗。按2009年国际妇产科联盟(FIG0)的分期标准，Ⅰ期20例、Ⅱ期15例、Ⅲ期13例、Ⅳ期2例;按有无淋巴结转移情况分为:有淋巴结转移12例，无淋巴结转移38例;按肿瘤细胞分化级别分为G1、G2、G3级，每级为21、19、10例。按肿瘤的浸润程度分:＜1/2肌层浸润为17例，≥1/2肌层或浆膜浸润为33例。收集同期EAH石蜡包埋标本30例作为EAH组，其中轻中度和重度各15例，患者年龄38～66岁，中位年龄48岁。取同期在我院因子宫肌瘤切除子宫患者的NE标本15例作为NE组，患者年龄32～53岁，中位年龄40岁。所有诊断均由两位以上病理医师确诊。

1.2方法

1.2.1免疫组化:采用Envision二步免疫组化染色法。兔抗人HIF-1α多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，所用的兔抗人VEGF多克隆抗体和兔抗人CD34多克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发公司，鼠抗人vasohibin多克隆抗体购自台湾Abnova公司。Envision二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6000)和DAB酶底物显色试剂盒等相关试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按Envision二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6000)说明操作，DAB显色，苏木精复染。已知的阳性对照片作阳性对照，PBS代替第一抗体作阴性对照。所有切片均采用同一批试剂完成。

1.2.2结果判断标准:细胞质或核内如有棕黄色颗粒即判定为阳性。在随机双盲的条件下，两名高年资病理科医师对切片观察，每张切片随机选择5个高倍镜(×400倍)，200个细胞/视野，共计1 000个细胞并取其平均数。根据目前应用较为广泛的免疫组化积分标准判断:①染色强度:无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分，阳性细胞数:阴性0分，阳性细胞数≤10%1分，11%～50%2分，51%～80% 3分，＞80% 4分。②采用半定量积分对各子宫内膜组织行阳性/阴性划分。半定量积分=染色强度评分×阳性细胞数评分。其中半定量积分0～1分定位阴性(－)，2～3分定位弱阳性(+)，4～6分定为中阳性(++)，＞6分定为强阳性(+++)。+～+++均为阳性，++～+++为过表达，－～+为表达缺失或低表达。

1.3统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关分析，以a=0.05(双尾)为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在3组子宫内膜组织中的表达情况

2.1.1Vasohibin-1在3组子宫内膜组织中的表达情况:在子宫内膜组织中，Vasohibin-1的阳性表达主要在细胞浆内，镜下可见呈棕黄色颗粒样染色。在15例NE组织中Vasohibin-1的阳性表达率为6.67%，在30 例EAH组织中的阳性表达率为16.67%，在50例EA组织中的阳性表达率为38%，三者呈逐渐递增趋势。NE组与EAH组的阳性率差异无统计学意义(χ2=0.22，P＞0.05)，但EA组的阳性表达率与NE组及EAH组差异有统计学意义(χ2=3.95、4.06，P＜0.05)。见图1、表1。

图1　EA中Vasohibin-1的阳性表达

表1　Vasohibin-1在3组子宫内膜组织中的表达情况　例

2.1.2VEGF在3组子宫内膜组织中的表达情况: VEGF阳性表达主要在子宫内膜组织的细胞浆内，呈棕黄色颗粒。VEGF在NE及EAH中阳性率分别为26.67%、40.00%，而EA组织中VEGF的阳性率为74.00%，阳性表达率逐渐升高。EA与NE组以及EAH组VEGF的阳性表达率之间差异均有统计学意义(χ2=11.10，9.13，P＜0.01)，而在NE和EAH组织中VEGF的表达差异无统计学意义(χ2=0.78，P＞0.05)。见图2，表2。

图2　EA中VEGF的阳性表达

2.1.3HIF-1α在3组子宫内膜组织中的表达情况: 与VEGF及Vasohibin-1不同，HIF-1α在子宫内膜组织中的阳性表达主要在细胞X核上，呈棕黄色颗粒染色。在NE、EAH及EA组织中，HIF-1α的阳性表达率分别为6.67%、43.33%、62.00%，呈逐渐升高趋势。NE组与EAH组、EA组的阳性率的差异有统计学意义(χ2=4.68、14.13，P＜0.05)，而EAH组与EA组间比较差异无统计学意义(χ2=2.64，P＞0.05)。见图3，表3。

表2　VEGF在3组子宫内膜组织中的表达情况　例

图3　EA中HIF-1α的阳性表达

表3　HIF-1α在3组子宫内膜组织中的表达情况　例

2.2Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α的表达与EA临床病理特征的关系

2.2.1Vasohibin-1的表达与EA临床病理特征的关系: Vasohibin-1在EA中的表达与病理分级、肌层浸润、临床手术分期、有无淋巴结转移和年龄等因素均无关。见表4。

表4　Vasohibin-1的表达与EA临床病理特征的关系　例

2.2.2VEGF的表达与EA临床病理特征的关系: VEGF在EA组织中的表达与临床手术分期有关(χ2=5.72，P＜0.05)，与病理分级、肌层浸润、有无淋巴结转移及年龄无关，随着临床手术的期别升高，VEGF的表达在子宫内膜组织中的表达阳性率升高。见表5。

表5　VEGF的表达与EA临床病理特征的关系　例

2.2.3HIF-1α的表达与EA临床病理特征的关系: HIF-1α在EA组织中的表达与临床手术分期有关，(χ2=5.53，P＜0.05)，随着临床手术分期的期别升高，HIF-1α的表达阳性率升高，而与病理分级、肌层浸润、有无淋巴结转移及年龄无关，这与VEGF的表达与EA病理学特性的关系相似。见表6。

表6　HIF-1α的表达与EA临床病理特征的关系　例

2.3VEGF、Vasohibin-1及HIF-1α在EA组织中表达的相关性

2.3.1EA组织中VEGF分别与Vasohibin-1、HIF-1α表达的相关性:在EA组织中，VEGF分别与Vasohibin -1、HIF-1α表达的呈同向变化，做相关性分析呈正相关(r分别为0.370、0.381，P＜0.01)。见表7。

2.3.2EA组织中Vasohibin-1与HIF-1α表达的相关性: Vasohibin-1与HIF-1α表达相关性分析，差异均无统计学意义(r=0.187，P＞0.05)。见表8。

表7　EA组织中VEGF与Vasohibin-1、HIF-1α表达的相关性分析例

表8　EA组织中Vasohibin-1与HIF-1α表达的相关性分析　例

3　讨论

血管新生对肿瘤组织生长和转移发挥重要的作用，研究表明肿瘤是通过调控血管生成因子和抑制因子之间的平衡来实现血管新生［3］。VEGF是已知最强的血管生成刺激因子之一。这种蛋白对血管内皮细胞具有特异性的促分裂增殖作用，同时具有极强的血管渗透性与细胞外基质互相联系，进而有利于肿瘤血管新生及浸润。本研究结果显示，在EA组织中存在VEGF表达的明显增高，同时VEGF的表达量与手术病理分期相关，而与EA细胞的分化、是否淋巴结转移及肌层浸润程度并无关系。这表明VEGF可能参与了EA的临床进展，并与预后密切相关，这与既往研究结果［4，5］一致。

Vasohibin家族蛋白是新近发现的一类血管生成调节因子，研究表明其在血管新生过程中同样发挥着重要作用［3］。Vasohibin-1是其家族的一员，主要作用是在血管内皮细胞血管新生的终止部位表达并终止血管新生。Vasohibin-1在卵巢癌、宫颈癌等妇科肿瘤中均存在广泛的表达。同样在子宫内膜癌中也可见广泛表达，如Yoshinaga等［4］分析了78例子宫内膜癌患者的病理标本后认为，在各组织病理分期的EA的vasohibin表达都高于正常组织(P＜0.05)且表达水平与肿瘤病理分期呈明显正相关。本研究结果表明在子宫内膜组织中，Vasohibin-1在NE、EAH以及EA组织中的阳性表达率呈逐渐递增趋势。而且EA组的阳性表达率远远高于NE组及EAH(P＜0.05)。这一结果与Yoshinaga等［4］的研究结果基本吻合。然而本研究中并未发现Vasohibin-1与病理分级存在明显的关系，考虑可能与研究中所含G3期的病例数较少有关。

然而Vasohibin-1与VEGF之间表达的相关性，前期的研究结果并不一致。

有研究认为Vasohibin-1与VEGF在子宫内容癌微血管中表达呈明显的一致性，且随着子宫内膜癌从高分化到低分化而表达依次升高，并呈强烈的正相关［4，5］，本研究结果表明Vasohibin-1与VEGF之间存在着表达的密切相关性。王珺等［6］研究结果表明，EA组织中的Vasohibin-1并没有在高水平的VEGF诱导下出现高表达，反而表达却明显降低。本研究结果表明Vasohibin-1与VEGF之间在EA组织中的表达呈明显的正相关，进一步支持了上述研究结果［4，5］。Vasohibin-1同样在乳腺癌［7］、宫颈癌［8］组织也呈高表达水平，并且表达与肿瘤的进展密切相关。Vasohibin-1作为血管新生的负反馈调节蛋白，其表达受多种因子的影响。如VEGF受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)可通过PKCδ途径介导Vasohibin-1的表达［9］。因此推测机体对于高水平的VEGF刺激，可进一步诱导产生负反馈调节蛋白Vasohibin-1来调控肿瘤的血管新生过程。

HIF-1α是一种在缺氧条件下活化的转录因子，其与靶基因上的缺氧反应元件结合，激活VEGF等靶基因的转录［10］。缺氧条件下，活化的HIF-1α顺式调节VEGF转录，使其过多表达，促进血管增生，改善组织氧供。本研究结果表明EAH及EA与NE中的HIF-1α表达具有显著差异，而且其与VEGF的表达一样与临床手术分期有关(χ2=5.53，P＜0.05)，提示HIF-1α与VEGF相互协调共同促进EA血管生成中。然而Vasohibin-1与HIF-1α在肿瘤组织中表达的相关性却并不明确，王智娜等［11］研究表明Vasohibin-1与HIF-1α在肝癌组织中均存在高表达且存在明显相关性，并认为二者在肝癌发生发展过程可能通过VEGF发挥作用。然而在EA组织中本研究结果表明两者之间表达并无明显相关性(P＞0.05)。从本研究结果推测，说明随着肿瘤的持续增长，细胞增殖加快，倍增时间进一步缩短，细胞内缺氧现象增加，缺氧的微环境通过HIF-1α的作用诱导VEGF表达水平持续上调，而Vasohibin-1未能在更高水平的VEGF的诱导下持续上调，可以在一定程度上解释本研究中Vasohibin-1的表达与临床手术分期无关，而VEGF和HIF-1α的表达却临床手术分期有关这一现象，同时也可以解释本研究中Vasohibin-1与HIF-1α在EA组织中表达没有明显的相关性。另外有报道称从正常子宫内膜血管内皮细胞中分离出一个小的Vasohibin结合蛋白SVBP，它可促进Vasohibin的溶解与分泌并维持其在内屏细胞中的含量进而阻止其泛素化作用，增强其抗血管生成活性［9］。但这种结合蛋白却未在子宫内膜癌中检测到，推测在子宫内膜癌组织中即使表达增加，然而活化的Vasohibin含量并不多。因此推测当肿瘤生长到一定阶段，这一内源性Vasohibin-1的表达上调并不能抑制EA组织中新生血管的形成，EA血管继续异常增生，最终导致肿瘤进展。

本研究结果在一定程度上解释了EA组织中血管异常增生的原因。但是Vasohibin-1与HIF-1α之间的关系目前尚不清楚，所以Vasohibin-1与VEGF之间可能存在与HIF-1α作用类似的旁路调节途径来调节两者之间的平衡。探索vasohibin在EA中表达的调控途径，促进其表达，将有望成为抑制EA血管生成的有效途径和治疗手段，成为治疗EA的新靶点。

参考文献

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·论著·

Expressions and significance of Vasohibin-1，VEGF，HIF-1α in endometrioid adenocarcinoma

LI Li，ZHOU Longshu， SHI Wenjing.
Department of gynaecology，The Second Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

【Abstract】Objective To investigate the expressions of vascular endometrial growth factor (VEGF)，hypoxia induced factor 1α(HIF-1α) and Vasohibin-1 in normal endometriums (NE)，endometrial atypical hyperplasia (EAH) and endometrioid adenocarcinoma (EA) tissues，and to explore the correlation between these indexes and clinicopathological characteristics of EA.MethodsThe expression levels of Vasohibin-1，VEGF and HIF-1α were detected by immunohistochemistry in 15 cases of NE，30 cases of EAH and 50 cases of EA tissues，and the correlation between these indexes and clinicopathological characteristics of EA was analyzed.Results The expressions levels of VEGF，HIF-1α，and Vasohibin-1 in EA tissues were significantly higher than those in NE tissues (P＜0.05).The expression levels of VEGF and HIF-1α were closely correlate to clinical surgical staging，which were increased with the advance of clinical stage (P＜0.05)，however，the expressions levels of Vasohibin-1 were not related with clinical surgical staging.The expressions of Vasohibin-1 and HIF-1α were positively correlated to those of VEGF in EA tissues (P＜0.01)，however，the expressions of Vasohibin-1 were not related with those of HIF-1α(P＞0.05).Conclusion The high－expression of Vasohibin-1，VEGF，HIF-1α is observed in EA tissues.The high levels of VEGF can increase the expression levels of Vasohibin-1，however，which can not inhibit neovascularization in EA tissues，thus，there may have the other bypass pathways to regulate the balance between them.

【Key words】endometrioid adenocarcinoma; Vasohibin-1; VEGF; HIF-1α

(收稿日期:2015－08－22)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.05.006

通讯作者:周龙书，510260广州市，广州医科大学附属第二医院妇科; E-mail: lili.py@163.com

【中图分类号】R 737.33

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 05－0662－05

作者单位: 510260广州市，广州医科大学附属第二医院妇科