VEGF在脊髓型颈椎病动物模型椎间盘组织中的表达及意义*

樊成虎，唐晓栋，肖正军，兰晓飞

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃中医药大学

VEGF在脊髓型颈椎病动物模型椎间盘组织中的表达及意义*

樊成虎1，唐晓栋1，肖正军2，兰晓飞2

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃中医药大学

目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在脊髓型颈椎病动物模型椎间盘组织中的表达及意义。方法：将脊髓型颈椎病大鼠模型中取得的椎间盘组织（造模组）进行HE染色及VEGF免疫组化检测，并与正常组作对照分析。结果：造模组大鼠颈椎间盘中髓核和纤维环VEGF的含量为74.10%和5.72%，分别高于对照组大鼠的28.40%和4.70%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：脊髓型颈椎病病变椎间盘内可诱导产生VEGF，提示VEGF可能通过促进新生血管的发生、发展，在退变的椎间盘组织中发挥作用。

脊髓型颈椎病；组织学；免疫组织化学；血管内皮生长因子

颈椎病是一种临床常见病，一般分型为局部型、神经根型、椎动脉型、脊髓型、交感型、混合型、食管压迫型等。其中脊髓型颈椎病(Cervical Spondylotic Myelopathy，CSM)约占颈椎病分型的10～15%。其早期多以隐匿侵袭形式发展，容易漏诊、误诊，后期致残率高［1］。一般认为形成脊髓型颈椎病的主要原因是颈脊髓、附属结构、血管受到来源于颈椎间盘退变、后凸、黄韧带增生肥厚、钙化，椎体骨赘增生等压迫或刺激所致。

正常椎间盘是一个无血管的组织，营养供应主要是通过两个途径被动扩散，一是终板途径，即椎体内血管的营养物质通过骨髓腔血窦-软骨终板界面扩散到椎间盘，营养髓核与纤维环内层，是椎间盘主要的营养途径；二是纤维环途径，即纤维环表面血管营养纤维环外层口［2］。突出的椎间盘进入硬膜外腔后其碎片主要特征是边缘区域有血管形成和巨噬细胞浸润。髓核穿破后纵韧带进入硬膜外腔后成为机体抗原，诱导以血管反应为中心的免疫性炎症，硬膜外腔小血管爬行长入，单核、巨噬细胞系统通过新生毛细血管网侵入到突出的椎间盘组织内，它们释放各种蛋白水解酶，分解髓核组织［3］。在椎间盘退变中可见新生血管生成的表现。有研究［4］发现血管形成、生长与许多细胞因子相关，血管内皮生长因子(VEGF)是其中一种重要的血管生长刺激因子［5］。陈飞等［6］研究表明退变椎间盘组织中有VEGF的表达，且VEGF的表达与退变程度呈正比。本研究通过动物造模法复制脊髓型颈椎病模型，并采用免疫组化技术检测并探讨VEGF在其中的表达和意义。

1 材料与方法

1.1 材料本实验采用植骨法复制大鼠脊髓型颈椎病(CSM)模型。选用健康雄性SPF级6月龄Wistar大鼠60只，实验动物许可证号：SCXK(甘) 2011-0001，体质量(250±20)g，经适应性喂养后，以随机数字表法抽取20只为正常对照组，其余40只为CSM造模组。从造模组中选取造模成功的20只大鼠称重，按体质量编号，并依照随机数字表法分组。

1.2 方法1)采用HE染色进行形态学观察；2)免疫组织化学法(SABC法)检验HIF-lα、VEGF的表达情况。3)免疫反应切片在BX60F／PM30-3型显微照相系统下观察并摄像。4)图片应用彩色病理图文分析系统进行免疫反应产物显微图像分析，得出平均光密度值和积分平均光密度值。

1.3 观察指标1)HE染色观察其中有无血管组织浸润，椎间盘组织中软骨细胞是否增生，纤维板状结构有无破坏，基质是否增生，以确定是否有退变。2)VEGF免疫组化染色中胞浆或胞膜中出现红色颗粒判断为VEGF阳性细胞。如果阳性细胞总数＞5%判断为阳性。

1.4 统计学方法数据采用SPSS 10.0统计软件分析，采用方差分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

1)对照组椎间盘组织基质少见，软骨细胞呈纺锺形，无血管组织浸润；而造模组椎间盘组织表现为软骨细胞增生，纤维细胞基质合成增多，纤维环板层状结构破坏，见图1—2。2)VEGF的表达：在造模组和对照组中均可见VEDF的阳性表达。造模组大鼠颈椎间盘中髓核VEGF的含量为74.10%，高于对照组大鼠的28.40%，造模组大鼠颈椎间盘中纤维环VEGF的含量为5.72%，高于对照组4.70%，2组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。

图1 造模组椎间盘组织呈现退变、炎性样改变(100×)

图2 免疫组化染色中胞浆中VEGF阳性细胞(100×)

3 讨论

人VEGF蛋白由美国科学家于1989年成功纯化与鉴定。VEGF早期亦称作血管通透因子(VPF)，是由2条相对分子质量各为24 000的单链，以二硫键组成的高度保守的同源二聚体糖蛋白。VEGF mRNA剪切方式不同，故可产生VEGFl21、VEGFl45、VEGFl48、VEGFl65、VEGFl83、VEGFl89和VEG206等7种蛋白形式［7］。作为一类多功能细胞因子，VEGF通过与受体特异性结合发挥作用。其生物学活性可表现为以下几点。1)促血管发生、生成和成熟VEGF是血管形成的中心调控者，在生理及病理性血管生成中起着至关重要的作用。Mattar等［8］发现，在重组人骨形态发生蛋白(rhBⅧ)-2基础上加入VEGF后血管生成数量(毛细血管密度)明显高于未加入组(单纯rhBMP-2)，说明VEGF促血管生成和发生的作用是明确的。2)对细胞外基质的作用EGF可改变细胞外基质(ECM)，使其利于细胞生长；同时在ECM的基础上，VEGF可发挥更强的促血管生成和发育的作用。3)增加血管通透性，Murata等［9］在研究大鼠糖尿病视网膜病变模型时发现模型中VEGF的免疫反应性明显增高，血管周围尤其明显，并在血管周围检测到外渗的白蛋白，说明VEGF可增加血管通透性。4)维持血管功能。VEGF通过刺激内皮细胞生长促进一氧化氮分泌，起到维持血管功能的作用。5)参与调节促进骨生成，VEGF在脊髓型颈椎病退变的椎间盘内表达呈阳性。Liu XW等［10］对观察组78只SD大鼠构建椎间盘退变模型，3个月后与对照组(8只正常SD大鼠)比较VEGF阳性表达率，结果观察组VEGF阳性率分别为74.4%，其中毛细血管渗透率达62.8%，均较对照组高且差异有统计学意义(P＜0.05)。孙小航等［11］观察不同月龄新西兰大白兔椎间盘组织中VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的变化情况，发现随着月龄的增加，椎间盘中各组织结构成分发生从生长、成熟到退变的相应变化。VEGF和bFGF的表达都经历了从有到无、再从无到有的变化，他们的表达强度也都随着月龄从强到弱、再从弱到强；并且VEGF和bFGF的表达和椎间盘组织结构的变化具有相似性。VEGF在不同时期和状态时在椎间盘中的表达提示它在椎间盘发育、成熟和退变过程中可能具有重要的调节作用。龙厚清等［12］发现胎儿椎间盘脊索细胞和纤维环外层血管内皮细胞出现阳性免疫染色，阳性率达87.5%，生长期和成人期椎间盘未见阳性表达；退变突出组总阳性率为83.3%，VEGF表达主要出现于破裂型和游离型椎间盘突出(P＜0.01)，提示胎儿期和破裂型(包括游离型)突出椎间盘组织可产生内源性VEGF，且对VEGF进行了定量，充分说明突出椎间盘中VEGF的阳性表达与病程、突出类型密切相关。

综上所述，VEGF在椎间盘中的高表达，标志着椎间盘退变的开始，并可诱导和加速椎间盘的退变。且在此过程中，VEGF均与血管浸润及椎间盘退变程度呈正相关。因此有观点认为，椎间盘的微环境中细胞因子的相互作用，表现为一个复杂的、立体的、多元的关系结构，而VEGF可能是其中关键作用点之一。退变颈椎间盘组织中VEGF的表达与突出类型相关，VEGF可能在抑制椎间盘的退变中发挥重要作用。HIF-lα和VEGF共同参与了椎间盘退变；HIF-lα可能通过上调VEGF的表达来促进椎间盘组织中新生血管的形成，进而延缓椎间盘退变的发生。但二者的协同机制需进一步完善研究。通过调节二者的活性防治椎间盘退变，对治疗脊髓型颈椎病提供了新的思路。

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Expression and Meaning of VEGF in Intervertebral Disc Tissue of Animal Model with Cervical Spondylotic Myelopathy

FAN Chenghu1,TANG Xiaodong1,XIAO Zhengjun2,LAN Xiaofei2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

B

1004-6852(2016)11-0132-03

2016-01-17

兰州市科技局项目(编号2011-2-35)。

樊成虎(1963—)，男，硕士研究生导师，教授，主任医师。研究方向：脊柱脊髓相关疾病的诊治。