陕产贯叶连翘挥发油的提取工艺优化及GC-MS分析

王　燕，高　洁，崔建强，王飞娟，张　爽，杨亚婷

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)



陕产贯叶连翘挥发油的提取工艺优化及GC-MS分析

王燕，高洁，崔建强，王飞娟，张爽，杨亚婷

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

摘要：以陕产中药贯叶连翘为原料，采用水蒸气蒸馏法对其挥发油进行提取和成分分析。以挥发油提取率为考核指标，采用单因素实验与响应曲面法相结合对挥发油的提取工艺进行优化，采用GC-MS对挥发油成分进行分析鉴定，并通过面积归一化法比较各组分的相对含量。确定了贯叶连翘挥发油的最佳提取工艺条件为：浸泡时间21 h、提取时间11 h、液固比5∶1(mL∶g)，在此条件下挥发油提取率为0.342 mL·(100 g)(-1)；经GC-MS分析鉴定出34种化合物，占总成分的94.01%。响应曲面法优化得到的贯叶连翘挥发油提取工艺稳定可靠，适用于陕产贯叶连翘挥发油的提取。

关键词：贯叶连翘；挥发油；响应曲面法；成分分析；GC-MS

贯叶连翘(Hypericum perforatumL.)，又名贯叶金丝桃，为藤黄科、金丝桃属多年生草本植物，是传统的药用植物，主要分布于陕西、甘肃、河北等地[1]。其药用历史达两千年之久，具有清热利湿、抑菌止血、疏肝解郁[2-3]、镇痛和治疗皮肤创伤等功效[4]。

贯叶连翘富含多种有效成分，关于其挥发油的提取、成分分析及应用已成为研究热点，其方法和药源的不同也影响挥发油的提取效率、化学组成及含量[5]。目前已有关于不同产地贯叶连翘中挥发油的研究[6]，然而对陕产贯叶连翘挥发油的提取工艺优化和化学组成分析的研究尚未见报道。

水蒸气蒸馏法具有得率较高、能耗较低、操作简单、无有机溶剂残留等优点[7]。目前，关于陕产贯叶连翘挥发油的水蒸气蒸馏提取研究较少，尤其是结合响应曲面法在连续范围内进行优化分析的研究还未见报道。作者在此采用水蒸气蒸馏法结合响应曲面法对陕产贯叶连翘挥发油的提取工艺进行优化，并运用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对挥发油成分进行分析和鉴定，拟为贯叶连翘的进一步开发利用提供参考。

1实验

1.1材料、试剂与仪器

贯叶连翘全草药材，陕西汉中，购自西安药材市场，粉碎备用。

无水乙醚、无水硫酸钠等，均为分析纯。

R-201型旋转蒸发仪；恒温水浴锅；QP2010型气质联用仪，日本岛津。

1．2方法

1．2.1挥发油的提取

准确称量80g贯叶连翘药材于挥发油提取器的圆底烧瓶中，再加入一定量的蒸馏水浸泡一定时间，用水蒸气蒸馏法加热回流提取挥发油，收集馏出液。用乙醚将馏出液反复溶出萃取3次，并用无水硫酸钠脱水干燥，按下式计算挥发油提取率Y[mL·(100g)-1]：

Y=V/m

式中：V为挥发油体积，mL；m为药材质量，g。

1.2.2挥发油提取工艺优化

1)单因素实验

按照1.2.1的方法，以挥发油提取率为考核指标，考察浸泡时间(8h、12h、16h、20h、24h)、提取时间(8h、11h、14h、17h、20h)、液固比(mL∶g，下同，4∶1、5.5∶1、7∶1、8.5∶1、10∶1)等3个因素对挥发油提取率的影响。

2)响应曲面实验

在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应曲面法对贯叶连翘挥发油的提取工艺进行优化，以挥发油提取率为响应值，对影响挥发油提取率的因素浸泡时间(A)、提取时间(B)和液固比(C)进行3水平实验设计，Box-Behnken设计的因素与水平见表1。

表1

Box-Behnken设计的因素与水平

Tab.1

Factors and levels of Box-Behnken design

按5个中心点设计安排实验，共进行17组实验。

1.2.3挥发油的GC-MS分析

气相色谱条件：载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)；进样量1.0 μL；柱流量1.00 mL·min-1；柱前压57.4 kPa；分流比1∶50；WDB-5弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，极性弱。

质谱条件：EI离子源，离子源温度200 ℃；GC-MS接口温度230 ℃；质量扫描范围(m/z)29～450；质谱检测起测时间2.5 min。应用SHIMADZU GC/MS Solution Release 2.10软件分析，NIST 147数据库进行检索，确定每一个组分的化学结构。

2结果与讨论

2.1单因素实验结果

2.1.1浸泡时间对挥发油提取率的影响

在提取时间14 h、液固比7∶1的条件下，考察浸泡时间对贯叶连翘挥发油提取率的影响，结果见图1。

图1　浸泡时间对挥发油提取率的影响

由图1可知，随着浸泡时间的延长，挥发油提取率逐渐上升；当浸泡时间为16 h时挥发油提取率最高，原因是浸泡可使药材组织细胞充分膨胀，细胞间隙变大，会加速细胞内外的物质交换，促进挥发油的提取；但当浸泡时间超过16 h后，挥发油提取率变化不大，可能与实验季节环境温度偏高、药材质量变异有关。因此，初步选择浸泡时间为16 h。

2.1.2提取时间对挥发油提取率的影响

在浸泡时间16 h、液固比7∶1的条件下，考察提取时间对贯叶连翘挥发油提取率的影响，结果见图2。

由图2可知，随着提取时间的延长，挥发油提取率明显升高；当提取时间为14 h时，挥发油提取率达到最高，之后随着提取时间的延长呈下降趋势，即油类组分减少。表明提取14 h时，挥发油基本提取完全。因此，初步选择提取时间为14 h。

2.1.3液固比对挥发油提取率的影响

在提取时间14 h、浸泡时间16 h的条件下，考察液固比对贯叶连翘挥发油提取率的影响，结果见图3。

图2　提取时间对挥发油提取率的影响

图3　液固比对挥发油提取率的影响

由图3可知，当液固比小于5.5∶1时，挥发油提取率变化不明显；当液固比大于5.5∶1时，挥发油提取率明显上升；当液固比为7∶1时，挥发油提取率达到最高；随后挥发油提取率变化相对稳定。原因可能为液固比小时不能充分浸泡药材原料；液固比过大，加热时溶液沸腾导致原料和挥发油沾壁，影响提取效果。综合考虑，初步选择液固比为7∶1。

2.2响应曲面实验结果(表2)

2.2.1回归模型方程的建立及其显著性检验

采用Design-Expert 8.0软件分析数据，得到的二元二次回归方程为：

Y=-0.054069+0.013245A+0.027903B+0.034875C+1.34896×10-3AB-4.58333×10-4AC+2.12500×10-3BC-8.98437×10-4A2-2.17361×10-3B2-4.66667×10-3C2。

表2

Box-Behnken设计挥发油提取率的预测值和实测值

Tab.2

Predicted and measured values of extraction

表3

方差分析

Tab.3

Variance analysis

2.2.2挥发油的响应曲面分析

水蒸气蒸馏法提取贯叶连翘挥发油的各个因素之间的响应曲面图见图4。

图4　各因素交互作用对挥发油提取率的影响

由图4a可知，保持液固比不变，随着浸泡时间和提取时间的延长，挥发油提取率先升高后降低，与拟合方程中浸泡时间的二次项和提取时间的二次项对响应值的影响程度一致，因此，浸泡时间的最佳水平范围为16～22 h，提取时间的最佳水平范围为10～16 h。

由图4b可知，挥发油提取率随浸泡时间的延长和液固比的增大出现先升高后降低的趋势，浸泡时间和液固比之间的交互作用对响应值有显著的影响，因此，浸泡时间的最佳水平范围为16～22 h，液固比的最佳水平范围为(5～9)∶1。

由图4c可知，提取时间和液固比之间的交互作用显著，可以确定提取时间的最佳水平范围为10～16 h，液固比的最佳水平范围为(5～9)∶1。

通过模型计算获得贯叶连翘挥发油的最佳提取工艺条件为：浸泡时间21.02 h，提取时间11.45 h，液固比5.45∶1。根据实际操作的需求，修正工艺条件为：浸泡时间21 h，提取时间11 h，液固比5∶1，该条件下平行实验3次得到贯叶连翘挥发油的提取率为0.342 mL·(100 g)-1，与挥发油提取率的预测值0.368 mL·(100 g)-1比较接近，表明该工艺是最优的。

2.3挥发油GC-MS分析

对挥发油进行GC-MS分析，按峰面积归一化法得到各成分相对含量，共分离出贯叶连翘挥发油的36种成分，鉴定出34种化合物(94.01%)，结果见表4。

由表4可知，贯叶连翘挥发油成分中正十六碳酸(16.39%)、4(14),11-桉叶二烯(9.20%)、十九醇(6.20%)、植醇(5.22%)、十二醇(5.14%)、二十一烷(3.79%)、α-柏木烯(3.72%)等成分相对含量较高。实验所得的陕产贯叶连翘挥发油成分与文献报道的湖南产和国产的贯叶连翘原药材粗粉的挥发油成分差异较大，与山东产的贯叶连翘挥发油成分较为接近[8-9]。原因可能与贯叶连翘挥发油的提取方法、部位、色谱条件和产地等不同有关[10-12]。

3结论

采用水蒸气蒸馏法对陕产贯叶连翘挥发油进行提取，在单因素实验基础上采用响应曲面法对提取工艺进行优化，获取的最佳工艺条件下贯叶连翘挥发油提取率为0.342 mL·(100 g)-1。通过GC-MS对贯叶连翘挥发油成分进行分析，共鉴定出34种化合物，可为陕产贯叶连翘的进一步开发利用提供参考。

参考文献：

[1]郭贺,王兴涌.贯叶连翘的研究进展[J].化学工程与装备,2007,(6):66-68.

[2]蒋尊成,花纯宏.贯叶连翘研究新进展[J].中医研究,2006,(6):63-64.

[3]吴敏,王霞,许平.贯叶连翘的研究进展[J].中成药,2004,26(9):74-77.

[4]毛淑才,刘展眉,郑康成.贯叶连翘提取物的研究新进展[J].时珍国医国药,2006,17(7):1303-1305.

[5]吴晶晶,何宇新,李玲.贯叶连翘的研究进展[J].时珍国医国药,2009,20(2):404-405.

[6]蒋声海.贯叶连翘的化学成分及其提取方法研究进展[J].中国实用医药,2010,5(32):231-233.表4

贯叶连翘挥发油的GC-MS分析结果

Tab.4

GC-MS Analysis results of volatile oil from Hypericum perforatum L.

[7]李宏,姜怀春,邹国林.贯叶连翘活性成分研究新进展[J].中草药,2001,32(7):83-86.

[8]曾虹燕,周朴华.贯叶连翘挥发性成分分析[J].中药材,2000,23(12):752-754.

[9]孟祥颖,郭良,杨明,等.贯叶连翘挥发油成分的分析[J].分析化学,2003,31(6):689-693.

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[11]吕英刚,刘世安,吴敏菊,等.山东贯叶连翘挥发油成分分析[J].中国中医药信息杂志,2007,14(8):42-43.

[12]王小芳,董晓宁,闫世才.贯叶连翘挥发性化学成分研究[J].西北植物学报,2006,26(6):1259-1262.doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.009

Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from ShaanxiHypericumPerforatumL. and GC-MS Analysis of Its Chemical Compositions

WANG Yan,GAO Jie,CUI Jian-qiang,WANG Fei-juan,ZHANG Shuang,YANG Ya-ting

(ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang712046,China)

Abstract：The volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L. was extracted by steam distillation,and its chemical compositions were analyzed by GC-MS.The extraction process was optimized by single factor experiment combined with response surface methodology.The contents of each component were compared based on peak area normalization.Results showed that the optimum extraction conditions were soaking time 21 h,extraction time 11 h and liquid-solid ratio 5∶1(mL∶g),respectively.Under optimized conditions,the extraction rate of volatile oil was 0.342 mL·(100 g)(-1),and 34 compounds were identified by GC-MS,accounting for 94.01% of the total amount of extracted compounds.This extraction process obtained by response surface methodology is stable and reliable.It is a feasible method to extract volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L..

Keywords：Hypericum perforatum L.;volatile oil;response surface methodology;composition analysis;GC-MS

中图分类号：R 284.2

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)03-0028-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.008

作者简介：王燕(1982-)，女，陕西西安人，讲师，主要从事天然药物有效成分研究，E-mail：370749824@qq.com。

收稿日期：2015-12-03

基金项目：陕西省中医药管理局中医药科学技术研究项目(15ZY034)，陕西省教育厅专项科研计划项目(12JK1044)，咸阳市科技成果推广计划项目(2015KT-26)