146株流感嗜血杆菌的分离培养与耐药分析

熊　冰，吴小娟，黄文红

(华润武钢总医院检验科，湖北武汉 430080)



·临床研究·

146株流感嗜血杆菌的分离培养与耐药分析

熊冰，吴小娟，黄文红

(华润武钢总医院检验科，湖北武汉 430080)

摘要:目的了解住院患者呼吸道标本培养中流感嗜血杆菌(HIN)的培养分离检出情况，同时结合药物敏感试验分析耐药情况。方法使用哥伦比亚血琼脂培养基，巧克力万古琼脂培养基结合革兰染色图片分离疑似流感嗜血杆菌，挑选可疑菌落进行卫星试验和Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子需求试验进行鉴定分离。用Nitrocefin 纸片法测定其β-内酰胺酶，采用纸片扩散法(K-B法)测定药物敏感试验结果，依照CLSI2012版标准判断结果，利用WHONET 软件对试验数据进行处理和分析。结果146株流感嗜血杆菌培养阳性标本直接涂片镜检均为合格标本，β-内酰胺酶阳性的流感嗜血杆菌检出率为32.6%(48/146)。146株流感嗜血杆菌对复方磺胺甲噁唑、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛、亚胺培南、环丙沙星、头孢噻肟、左氧氟沙星的耐药率分别为64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。β-内酰胺酶阳性的流感嗜血杆菌的耐药率明显高于β-内酰胺酶阴性株。结论实验室人员应重视提高流感嗜血杆菌分离率。β-内酰胺酶是流感嗜血杆菌耐药的主要机制，其耐药问题不容忽视，应定期统计其药物敏感试验数据，为临床使用抗菌药物提供指导依据。

关键词:流感嗜血杆菌；分离培养；β-内酰胺酶；耐药性

流感嗜血杆菌是一类无动力、无芽孢的革兰阴性小杆菌，是社区获得性呼吸道感染的主要病原菌之一，也可侵入血液、皮肤黏膜引起脑膜炎、肺炎及败血症等严重感染。流感嗜血杆菌属于苛氧菌，对其的分离培养反映着实验室的鉴定水平；近年来，由于抗菌药物的过度使用，其耐药率不断升高。为了解本院各科室呼吸道标本中流感嗜血杆菌的分离检出情况和耐药状况，本文将对本科室2013年1月至2014年12月流感嗜血杆菌的分离培养与耐药情况进行统计分析。

1资料与方法

1.1标本来源选择本院2013年1月至2014年12月住院患者合格的呼吸道疑似标本395例，包括自然咳痰200例、导管吸痰130例、纤支镜毛刷刷取物35例、肺泡灌洗液30例等。其中330例来自于成人标本，年龄19～71岁、平均(45±26)岁；65例来自于儿童标本，年龄3～14岁、平均(8±5.5)岁。

1.2试剂血平板、巧克力平板(含0.5 mg/mL万古霉素)、水解酪蛋白(MH)培养基、HTM药物敏感试验培养基均由广州迪景公司提供。Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子，复方磺胺甲噁唑、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛、亚胺培南、环丙沙星、头孢噻肟、左氧氟沙星药物敏感试验纸片均购自英国Oxoid公司。

1.3标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、流感嗜血杆菌ATCC10211。

1.4方法

1.4.1菌株的分离与鉴定将收到的送检标本同时接种于血平板和巧克力平板，37 ℃ CO2培养缸24 h培养后，挑取血平板上不长，巧克力平板上的透明或半透明、扁平、湿润的露滴状菌落涂片染色[1]，革兰阴性杆菌列为疑似菌落重新转种于巧克力平板，置37 ℃ CO2培养缸培养24 h后，挑取单个菌落配制成0.5麦氏浊度菌悬液，均匀涂布在MH琼脂表面和血平板表面，置室温干燥3～5 min，血平板上点种金黄色葡萄球菌进行卫星现象试验，MH培养基贴Ⅴ因子、Ⅹ因子、Ⅴ+Ⅹ因子纸片，纸片间距24 mm，置37 ℃ CO2培养缸培养24 h后观察。血平板上卫星试验阳性同时不溶血的菌落，MH平板上同时需要Ⅴ因子、Ⅹ因子均为阳性的鉴定为流感嗜血杆菌。

1.4.2药物敏感试验试验挑取鉴定合格的菌落，以流感嗜血杆菌ATCC10211为质控菌株，采用纸片扩散法(K-B法)分别进行复方磺胺甲噁唑、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛、亚胺培南、环丙沙星、头孢噻肟、左氧氟沙星8种抗菌药物的敏感性测定，按美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012版[2]的判定标准测量抑菌圈直径，以及判定耐药和敏感。

1.4.3β-内酰胺酶试验采用头孢硝噻酚法，在头孢硝噻酚纸片上加1滴无菌生理盐水，纸片浸湿后将菌落涂布于纸片上，10 min 内变红表示为β-内酰胺酶阳性菌株。

1.5统计学处理应用WHONET5.6对试验数据进行统计分析。

2结果

2.1流感嗜血杆菌的分离培养情况395例疑似标本均为合格非重复标本，共分离出流感嗜血杆菌146株，均来自于住院患者痰标本。其中10岁以下儿童患者分离出56株，占38.4%；20～50岁患者分离出10株，占6.4%；60岁以上患者分离出80株，占54.8%。

表1　　146株流感嗜血杆菌对8种抗菌药物的

续表1　　146株流感嗜血杆菌对8种抗菌药物的

2.2药物敏感试验分析146株流感嗜血杆菌对复方磺胺甲噁唑、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢呋辛、亚胺培南、环丙沙星、头孢噻肟、左氧氟沙星的耐药率分别为64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。

2.3β-内酰胺酶试验146株流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阳性株共检出48株(32.6%)，产酶株与不产酶株的耐药率见表1。

3讨论

流感嗜血杆菌较广泛地寄居于健康人上呼吸道，通常以冬季带菌率较高，发病也增多，可引起人类原发性化脓性感染，也可引起继发性感染[3]。原发性感染由b型荚膜强毒株引起，为急性化脓感染，如脑膜炎、鼻咽炎、心包炎、败血症等，以小儿多见。继发性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺结核等感染后发生，多为无荚膜菌株引起，如慢性支气管炎、中耳炎、鼻窦炎等，多见于成年人。本研究中146例分离株均来自痰标本，说明流感嗜血杆菌主要引起上呼吸道感染。国外也有文献报道流感嗜血杆菌引起泌尿生殖道炎症，阳性率不高却有着重要意义[4]，国内类似报道少见，这可能与流感嗜血杆菌的营养要求较高、普通血琼脂平板上不易生长有关。流感嗜血杆菌的生长需要Ⅴ、Ⅹ因子，且在5%～10% CO2条件下才能生长，因此本研究采用加入万古霉素的巧克力平板来分离临床标本中的流感嗜血杆菌，加入0.5 mg/mL万古霉素抑制革兰阳性菌株和其他细菌的生长。

由于儿童及老年人的抵抗力较弱，所以比较容易感染此菌，近年来，流感嗜血杆菌的感染率呈上升趋势，其分离鉴定对临床诊断有较高的参考意义，因此各实验室应重视对其的培养检出。

由于抗菌药物的过度使用，流感嗜血杆菌的耐药率与耐药范围也在逐步扩大。本研究中对复方磺胺甲噁唑的敏感性已不足40%，该药不再适合临床使用；氨苄西林的耐药率有44.5%，而产β-内酰胺酶株的耐药率更是达到了100.0%，这说明产β-内酰胺酶是流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制。青霉素类抗菌药物原为治疗流感嗜血杆菌的首选药物，但是由于临床滥用抗菌药物，而导致氨苄西林的耐药株不断增多，给诊断和治疗带来一定的困难，这与桂和翠等[5]的研究报道结果一致。流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药机制主要是菌株产生质粒介导的β-内酰胺酶，其中90%以上为TEM-1型基因，少数为ROB-1型基因所编码，β-内酰胺酶水解了氨苄西林分子结构上的β-内酰胺环，使氨苄西林失去活性而耐药。而β-内酰胺酶阴性株则主要是由染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和细胞膜对抗菌剂通透性的改变引起，因此氨苄西林已不适用于临床应用。本实验室分离出的β-内酰胺酶阳性株占总株数的32.6%。

其他抗菌药物头孢呋辛、亚胺培南、头孢噻肟、左氧氟沙星均较敏感，耐药率较低，不超过10%，与赵蕾[6]的报道结果一致，因此在本院治疗流感嗜血杆菌引起的呼吸道感染时，可优先选用头孢呋辛、左氧氟沙星，必要时使用头孢噻肟、亚胺培南。随着抗菌药物的用量和时间的关系，流感嗜血杆菌的耐药性可能会发生改变，因此用药过程中应定期进行细菌培养，尤其是对儿童患者和60岁以上中老年患者，调整抗菌药物的种类和用量。微生物实验室应重视和加强流感嗜血杆菌的培养及耐药性监测工作以指导临床医生合理使用抗菌药物。

参考文献

[1]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].2版.南京：东南大学出版社，1997：501-511.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S22 Performance standards for antimicrobial.susceptibility testing；twenty-secdond informational supplement[S].Wayne，PA，USA：CLSI，2012：96-99.

[3]朱旭慧，孙自镛，李丽，等.流感嗜血杆菌的分布及耐药性分析[J].实验与检验医学，2010,28(2):114-116.

[4]Vazquez F,Andres MT,Palacio V,et al.Isolation of haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae in genitourinary infections:a 4-year review[J].Enferm Infecc Microbiol Clin，1996，14(3):181-185.

[5]桂和翠，王中新，沈继录.48株流感嗜血杆菌耐药性分析及β-内酰胺酶基因检测[J].安徽医科大学学报，2012，47(1):56-59.

[6]赵蕾.57株流感嗜血杆菌的耐药性分析及分布[J].中华实验和临床感染病杂志2013,7(4)：527-529.

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.032

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0792-03