生殖道白色念珠菌耐吡咯类药物的基因表达*1

罗妙玲，徐韫健，李倩珺

(1.海珠区第一人民医院检验科，广东广州 510220；2.广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120)



·论著·

生殖道白色念珠菌耐吡咯类药物的基因表达*1

罗妙玲1，徐韫健2△，李倩珺2

(1.海珠区第一人民医院检验科，广东广州 510220；2.广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120)

摘要:目的了解生殖道白色念珠菌耐吡咯类药物基因的表达情况。方法收集真菌性阴道炎患者分泌物标本93份，分离白色念珠菌后用纸片扩散法进行药敏试验，裂解法提取白色念珠菌的吡咯类药物耐药株和敏感株的总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR技术检测白色念珠菌多药耐药基因CDRl、CDR2、MDRl的表达情况。结果共培养出59株白色念珠菌，18株热带念珠菌，10株克柔念珠菌，6株光滑念珠菌；白念珠菌中37株对氟康唑、酮康唑、咪康唑不同程度耐药，耐药率分别为16.7%、18.3%、51.7%；白念珠菌耐药株CDR1基因的2(-△△Ct)为1.46±0.24，敏感株为1.09±0.27，两组比较，差异有统计学意义(t=-4.22，P=0.001)；CDR2及MDRl基因的表达差异均无统计学意义(P=0.170，P=0.800)。结论白色念珠菌耐药机制较为复杂，可能与CDR1高表达有关，CDR2和MDR1表达与耐药性的关系有待进一步研究。

关键词:生殖道；白色念珠菌；基因表达；吡咯类药物

外阴阴道念珠菌病(VVC)是一种由念珠菌引起的阴道黏膜真菌性感染，近年来发病率有明显上升的趋势[1]。由于吡咯类药物，如酮康唑、氟康唑、咪康唑等具有抗菌谱广、不良反应少等优点，已成为临床治疗真菌感染的首选药物，然而，近年来吡咯类药物的大量应用导致耐药性越来越严重。念珠菌的耐药机制主要有麦角甾醇合成通路中关键靶酶的变化造成膜成分的改变，生物被膜的形成，编码药物外排泵的基因表达增加，细胞膜对药物通透性改变等[2]。其中外排基因CDR1、CDR2、MDR1过度表达是产生耐药的主要原因。因此，本文就门诊患者阴道分泌物中分离的白色念珠菌对吡咯类药物相关耐药基因的表达进行研究，从分子水平了解耐药机制，以期为临床治疗提供参考依据。

1资料与方法

1.1一般资料2015年1～2月广州市海珠区第一人民医院与广州医科大学附属第一医院妇科门诊就诊的真菌性阴道炎患者93例，年龄20～45岁，均有典型的豆腐渣样白带和外阴瘙痒等症状，留取阴道分泌物标本，直接革兰染色镜检发现菌丝或孢子。

1.2仪器与试剂Total RNA 提取试剂、PCR 检测试剂及DNA 标记物均购自大连宝生物工程有限公司；金星 TaqMan预混体系试剂购自上海生工生物技术有限公司；沙氏培养基和真菌药敏培养基购自法国梅里埃生物公司；氟康唑(15 μg)、酮康唑(15 μg)和咪康唑(10 μg)药敏纸片购自丹麦Rosco公司；Vitek-2 Compact细菌鉴定仪购自法国生物梅里埃公司；CFX 96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3引物及探针设计参考GenBank设计CDR1、CDR2、MDR1和内参基因的引物，由上海生工生物技术有限公司合成，引物及探针序列见表1。

表1　　引物及探针序列

1.4方法

1.4.1真菌培养和药敏试验将分泌物转接到沙氏琼脂培养基平板上培养72 h，有菌落生长者涂片做革兰染色，镜下观察为念珠菌者，接种至科马嘉念珠菌显色培养基上，48 h后观察颜色，判别菌种，无法鉴定者通过Vitek-2 Compact细菌鉴定仪鉴定。对菌株进行纸片扩散(K-B)法药敏试验，置于温箱37 ℃培养24 h后测量抑菌圈，依据表2标准判断药敏情况。

表2　　吡咯类药物抑菌环直径的判断标准(mm)

1.4.2总RNA的抽提液氮裂解白色念珠菌的细胞壁，用氯仿和异丙醇提取总RNA，用超微量紫外分光光度计测定总RNA样品纯度及浓度。

1.4.3逆转录和实时荧光定量PCR扩增逆转录体系：PrimeScript RT标记混合液2 μL，总RNA(根据浓度确定加入量，10 μL体系最大使用500 ng)，RNase Free dH2O加至10 μL；反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时荧光定量PCR扩增体系：PCR mix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase Free dH2O 10 μL，探针0.5 μL，cDNA 1 μL。发光基团为5′-FAM，淬灭基团为TAMRA。扩增程序：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40个循环。计算方法如下：目的基因相对表达量=2-△△Ct,△△Ct=目的基因的Ct值-内参基因的Ct值。

2结果

2.1培养及鉴定结果93例女性的阴道分泌物均培养出念珠菌，其中59株为白色念珠菌，占63.4%，18株为热带念珠菌，10株为克柔念珠菌，6株为光滑念珠菌。

2.2吡咯类药敏试验结果59株白色念珠菌菌株经过药敏试验后，其中37株对咪康唑、酮康唑、氟康唑中一种或以上药物耐药，耐药率分别为51.7%、18.3%、16.7%，37株纳入耐药组。从敏感株中选取10株纳入敏感组。

2.3CDR1、CDR2及MDR1的表达水平实时荧光定量PCR检测到各基因的Ct值，经计算，耐药组CDR1基因2-△△Ct值明显高于敏感株组，差异有统计学意义(P=0.001)；而CDR2和MDR1基因2-△△Ct值在耐药组与敏感组中的差异均无统计学意义(P=0.170,P=0.800)，见表3。

表3　　耐药组和敏感组基因2-△△Ct比较±s)

3讨论

白色念珠菌对吡咯类药物耐药主要有以下三条途径：药物作用靶位的变化；外排泵基因如CDR1、CDR2、MDR1的过度表达，细胞对药物的主动外排，减少了唑类抗真菌药物在胞体内的累积；细胞膜对药物通透性改变，使细胞摄取和积聚药物的量降低[3-4]。其中，白色念珠菌的药物外排能力增强导致胞内药物浓度降低是主要的耐药机制。目前已知与吡咯类药物外排有关的跨膜转运蛋白有两类：一类是含ATP结合转运蛋白，是ATP能量依赖型多药转运载体，是细胞膜上的外排机能泵，其与耐药有关的主要有CDR1和CDR2基因编码的Cdr1p蛋白和Cdr2p蛋白；另一类是主要易化载体超家族蛋白，是非能量依赖型载体，其与耐药有关的主要是由MDR1基因编码的Mdr1p蛋白。相关文献报道Cdr1p、Cdr2p蛋白以降低细胞内药物浓度的方式来增加药物的外排[5]，而Mdr1p蛋白则通过抑制药物摄入来实现。

荧光定量PCR是一种准确、有效的核酸定量分析技术，相对定量主要应用于mRNA表达量解析，先测定目的基因的相对表达量，再进行样品间相对量的比较。本研究通过采用相对定量TaqMan探针法，引入内参基因，将目的基因表达量进行归一化处理，以消除初始RNA的差异带来的表达差异。本研究结果显示耐药组与敏感组CDR1基因在mRNA表达水平上存在差异，表明耐药组CDR1基因的高表达可能与耐药形成有关。相关文献报道白色念珠菌耐药多以CDR1或CDR2表达上调为主[6-7]。CDR1和CDR2基因所编码的转运蛋白在氨基酸序列上有高度同源性，所转运的底物相似，结合本课题组前期的结果[8-9]，本研究认为CDR1外排能力更强，在耐药形成中发挥作用更大。但CDR2和MDR1表达差异无统计学意义(P>0.05)，不能证明其与耐药无关，跨膜转运蛋白外排泵的两种类型编码基因的调节是相互独立的，在大多数吡咯类药物耐药株中仅过表达其中一种外排泵；白色念珠菌耐药性的形成是通过多因素的调节，体内长期演变实现的，基因表达增加只是引起耐药的原因之一。

抗真菌药物的滥用导致吡咯类药物产生不同程度的耐药，应从分子水平、生物膜形成等方面进一步探究药物作用靶位，或探索更好的联合用药方案，如李丰霞等[10]发现汉防己甲素对氟康唑抗菌活性有增强作用，Zhu等[11]发现氟康唑和小檗碱联合用药可通过阻断CDR1转录因子结合药物作用元件达到抗菌作用。主动外排泵蛋白基因过度表达在多药耐药产生中的作用已逐渐被重视，本文对生殖道白色念珠菌耐药分子机制的研究有助于发现新的作用靶位点和研制泵抑制性抗真菌药物。

参考文献

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Expression of pyrrole drugs resistance genes in Candida albicans from genital tract*1

LuoMiaoling1,XuYunjian2△,LiQianjun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HaizhuDistrictFirstPeople′sHospital,Guangzhou,Guangdong510220,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of resistance genes in pyrrole resistant Candida albicans from genital tract.MethodsThe Candida albicans were isolated from the vaginal secretions of 93 vaginitis patients,and Kirby-Bauer method was performed for preliminary culture of strains resistant.The total RNA was extracted from pyrrole-resistant and susceptible Candida albicans isolated by pyrolysis method and cDNA was synthesized.The expression of CDR1,CDR2,MDR1 genes was then detected by Real-time quantitative PCR.ResultsA total of 59 strains of Candida albicans,18 strains of Candida tropicalis,10 strains of Candida krusei and 6 strains of Candida glabrata were cultured.37 strains of Candida albicans were resistant to fluconazole,ketoconazole,and miconazole at different degrees,and the drug resistance rates were 16.7%，18.3%，51.7%;CDR1 gene′s 2(-△△Ct) in sensitive strains group was 1.09±0.27,while resistant strains group was 1.46±0.24,there was significant difference between two groups (t=-4.22,P=0.001).There was no significant difference in the expression of CDR2 and MDR1 genes between the sensitive and resistant strains(P=0.170，P=0.800).ConclusionThe drug resistance of Candida albicans mechanism is complicated,it might be associated with high CDR1 expression,the relationship between CDR2,MDR1 expression and multidrug resistance needs further study.

Key words:genital tract；Candida albicans;genes expression；pyrrole drugs

(收稿日期：2016-01-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.001

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0721-03

基金项目：广东省临床重点专科建设项目(2013)。

作者简介：罗妙玲，女，主管技师，主要从事临床检验技术研究。(△)通讯作者，E-mail:vinkent@126.com。