核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在阿尔茨海默病和血管性痴呆患者中的表达及相关因素研究①

柏　华，杨　波，余德军，张启芳



核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在阿尔茨海默病和血管性痴呆患者中的表达及相关因素研究①

柏华1a,1b，杨波1c，余德军1a，张启芳2

[摘要]目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)对痴呆发病的影响。方法2014年1月～2015年10月，用RT-PCR方法检测16例阿尔茨海默病(AD)患者、22例血管性痴呆(VD)患者和20名年龄相似的健康体检者外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA水平；ELISA法检测血清中白细胞介素(IL)-1β和IL-18蛋白水平；收集患者外周血白细胞计数(WBC)和血清总钙浓度等临床检测资料；将NLRP3 mRNA水平分别与IL-1β、IL-18、WBC和钙浓度进行单因素相关分析。结果NLRP3 mRNA水平由高到低依次为AD组>VD组>健康组(q>11.48,P<0.05)；IL-1β水平AD组高于健康组(q=16.74,P<0.05)，AD组与VD组、VD组与健康组无显著性差异(P>0.05)；IL-18水平各组间均无显著性差异(P>0.05)。AD组中，NLRP3 mRNA水平与IL-1β水平(r=0.64)、血清钙水平(r=0.58)呈正相关，与IL-18、WBC无相关性(P>0.05)。结论NLRP3炎症小体中相关蛋白或基因表达与AD的发病可能有较大关系，与VD的发病关系不大。

[关键词]阿尔茨海默病；血管性痴呆；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；炎症；发病

[本文著录格式]柏华，杨波，余德军，等.核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在阿尔茨海默病和血管性痴呆患者中的表达及相关因素研究[J].中国康复理论与实践,2016,22(3):306-309.

CITED AS:Bai H,Yang B,Yu DJ,et al.Expression of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3 in patients with Alzheimer's disease and vascular dementia and related factors[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):306-309.

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性的大脑变性疾病，是导致老年人痴呆最常见的原因之一。AD主要的病理变化是神经炎性斑块和神经原纤维缠结，这两者均可能与大脑中非特异性炎症的发生有一定关系[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3,NLRP3)在AD发病中的作用越来越引起重视。Heneka等发现，NLRP3在AD患者中由于caspase-1基因高表达而被活化，并有助于APP/PS-1转基因小鼠大脑老化病灶的形成；通过减少大脑caspase-1和白细胞介素(interleukin,IL)-1β的活性，有助于β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的清除[2]。

血管性痴呆(vascular dementia,VD)也是一种引起老年人群痴呆发生的常见疾病。通常认为梗死或出血的脑组织越多越容易发生VD，发生血管病变的部位与智力关系越密切越容易发展成VD。最近有学者发现，VD患者大脑也有炎症发生[3]。

模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)在固有免疫反应中有重要作用，NLRP3既是PRR中的重要成员，也是炎症小体中的重要成分[4]。为了探讨AD和VD发病机制的异同，我们比较NLRP3在AD和VD患者中表达的差异。

1资料与方法

1.1一般资料

2014年1月～2015年10月在贵州医科大学第三附属医院神经内科和精神心理科住院的AD患者16例，VD患者22例。

痴呆的诊断由经过培训的专科医师按照简明精神状态检查进行评分。参照2011年美国国立老化研究所和阿尔茨海默病协会修订的NINCDS-ADRDA标准诊断AD，即缺血指数量表(Hachinski Inchemic Score,HIS)评分≤4分，并排除其他大脑变性疾病和代谢障碍性疾病所致的痴呆。参照美国国立神经病与卒中研究所/瑞士神经科学研究国际会议(NINDS-AIREN)制定的诊断标准诊断VD[5]，且HIS评分≥7分。共筛查30例可疑VD患者，22例临床诊断为VD，其余8例有血管性认知功能障碍，但未达到VD临床诊断标准。

AD患者中，男性9例，女性7例；平均年龄(68.8±12.1)岁；平均病程(8.5±3.2)年。VD患者中，男性12例，女性10例；平均年龄(67.4±11.8)岁；平均病程(12.6±3.9)年。

在贵州医科大学第三附属医院体检科方便抽取中老年人20名(健康组)，平均年龄(67.9±10.5)岁。

收集AD组和VD组的血常规检查资料和血液电解质检查资料。

本研究获得贵州医科大学第三附属医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 RT-PCR

收集EDTA抗凝血液标本，淋巴细胞分离液(Ficoll)分离外周血单个核细胞(PBMC)，用Trizol试剂盒(INVITROGEN公司)进行抽提细胞总RNA，加入无RNA酶的超纯水50 μl溶解RNA。用紫外分光光度计检测RNA吸光度，计算A280/A260比值约1.9左右。用逆转录试剂盒进行cDNA合成，严格按试剂盒说明书操作，使用德国FlexCyxler PCR仪。根据GenBank中人肌动蛋白(β-actin)和NLRP3基因设计引物。

NLRP3上游：5'-CTT CCT TTC CAG TTT GCT GC-3'；下游：5'-TCT CGCAGT CCACTT CCT TT-3'

β-actin上游：5'-ATG ATG GCT TAT TAC AGT GGC AA-3'；下游：5'-GTC GGA GAT TCG TAG CTG GA-3'。

95℃30 s预变性，95℃30 s变性，55℃30 s退火，70℃1 min延伸，共36个循环。

扩增产物用含GreenView核酸染料的1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪曝光，BIO-RAD Quantity-One软件测量灰度值，与内参β-actin灰度值的比值代表NLRP3 mRNA表达量。

1.3 ELISA

IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。使用BIO-RAD-680型酶标仪，630/450 nm双波长测定OD值，以OD值为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算样品浓度。

1.4统计学分析

2结果

2.1各测量指标水平

NLRP3 mRNA表达(图1)AD组高于健康组(q= 18.23,P=0.003)和VD组(q=15.65,P=0.007)，VD组高于健康组(q=11.48,P=0.024)。IL-1β水平AD组高于健康组(q=16.74,P=0.036)，AD组与VD组、VD组与健康组间均无显著性差异(P>0.05)；IL-18水平各组间均无显著性差异(P>0.05)。见表1。

AD组和VD组WBC和血清钙浓度见表2。

图1　RT-PCR检测结果

表1　各组NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18水平比较

表2　AD组和VD组WBC和血清钙浓度比较

2.2相关性分析

AD组中，NLRP3 mRNA表达与IL-1β(r=0.64)、钙浓度(r=0.58)呈正相关(P<0.05)，与IL-18或WBC无相关性(P>0.05)；VD组中，NLRP3 mRNA表达与IL-1β、IL-18、WBC、钙浓度均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3　AD组和VD组NLRP3 mRNA与其他指标的相关性分析

3讨论

AD患者以Aβ在大脑海马中过度沉积和Tau蛋白异常磷酸化为主要发病机理，Aβ的生成和清除失调很可能是AD发病的始动环节或中心事件[6]。过度累积的Aβ通过激活蛋白激酶，促进Tau蛋白磷酸化，引发慢性炎性，激活细胞凋亡，发生氧化应激，最终引起神经细胞变性死亡[7]。目前开发的AD治疗药物主要试图抑制Aβ炎性斑块形成，阻止Tau蛋白异常磷酸化。抑制Aβ诱导的炎性反应尤其受到重视。

NLRP3炎性小体是由NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)和效应蛋白caspase-1组成的大分子复合体[8]。NLRP3炎性小体与固有免疫系统功能的正常发挥有重要关系，如果对其调控失衡，可能导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18等大量生成，通过相关信号转导通路，引发一系列炎症瀑布反应，最终参与包括AD在内的多种炎症性疾病的发生和发展[9]。最近有学者发现，Aβ可通过激活小胶质细胞NLRP3炎性小体，导致脑内炎症反应，引起神经元损伤和死亡，进而引发AD[10]。固有免疫系统作为机体的第一道保护屏障，能够通过PRR识别病原相关分子，以抵抗外来病原体的入侵和修复机体损伤[11]；NLRP3蛋白作为PRR-NLR家族中的重要成员，能够识别细胞内的病原体以及细胞自身产生的危险信号，从而保持机体健康。从固有免疫系统角度研究AD的发病机制有重大的病理生理学意义。

本研究提示，NLRP3基因的高表达在AD、VD的发病中均能起一定作用。Murphy等发现，用Aβ处理大鼠神经胶质细胞后，经由组织蛋白酶依赖性的NLRP10降解作用，NLRP3炎症小体有所形成和活化，其中NLRP3蛋白明显增加[12]。这一结果提示，NLRP3主要诱发AD发病，而对VD的发生作用可能有限。由于本次检测样本量不大，缺乏国外同类资料横向比较，确切的临床生物学意义还有待探索。下一步我们还考虑检测痴呆患者血液中NLRP3蛋白的变化，以比较VD组与AD组的差异。

NLRP3有助于APP/PS-1转基因小鼠大脑中老化病灶的形成，很可能是通过caspase-1和IL-1β介导而起作用[2]。本研究显示，IL-1β在AD发病中起一定作用，但在VD的发病意义不大；而IL-18虽然是NLRP3炎症小体的下游分子，但对AD或VD发病的意义均很有限。Halle等用Aβ处理小神经胶质细胞，加有溶酶体抑制剂细胞松弛素D或组织蛋白酶B抑制剂处理组中，IL-1β表达均减少，提示Aβ通过溶酶体破裂途径激活NLRP3炎性小体诱导IL-1β表达，并促进AD进展[13]；有时Aβ能够诱导大量IL-1β表达，促进AD发生和发展，在此过程中NLRP3起关键作用[14]。

在AD的发病机制中，钙离子失衡也有较大作用。钙离子在突触的发育和重塑、神经存活等方面起重要作用，钙离子过多进入细胞内将导致细胞内钙超载，引起神经细胞死亡[15]。本研究显示，如果单纯分析患者血液WBC和血清总钙浓度，并无异常情况；但AD患者NLRP3 mRNA与血清总钙浓度呈正相关，与WBC无关；VD患者NLRP3 mRNA与这两者均无相关性。提示NLRP3在AD发病中的作用可能与血液中钙离子浓度的增高有一定关系。另外我们发现，AD患者NLRP3 mRNA表达与IL-1β呈正相关，而在VD患者中两者无明显相关，提示IL-1β在AD的发病中可能更重要，而与VD发病的关系有待进一步分析。

在AD病程进展中，关于钙离子与IL-1β或NLRP3的相互作用可能是很复杂的网络调控，确切的机理还不清楚。有学者认为，钙离子与钙敏感受体(calcium sensing receptor,CASR)结合，激活NLRP3炎性小体；活化的CASR一方面降低细胞内的cAMP浓度，以解除cAMP对NLRP3的抑制作用，另一方面还可以诱导内质网释放钙离子，使细胞内钙离子水平持续升高，导致线粒体功能受损，并释放mtDNA诱导NLRP3炎性小体活化[15-16]。

总之，NLRP3炎性体的作用有可能是Aβ代谢异常诱导AD发生发展的关键环节，针对这一环节深入研究有望对AD的治疗产生新的突破。

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Expression of Nucleotide-binding Oligomerization Domain Receptor Protein 3 in Patients with Alzheimer's Disease and Vascular Dementia and Related Factors

BAI Hua1a,1b,YANG Bo1c,YU De-jun1a,ZHANG Qi-fang2
1.a.Medical Laboratory Center;b.Department of Neurology;c.Department of Psychiatry;the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Duyun,Guizhou 558000,China;2.Key laboratory of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 555000,China

Correspondence to BAI Hua and ZHANG Qi-fang.E-mail:baihcd@126.com(BAI Hua),gracezhang886@hotmail.com(ZHANG Qi-fang)

Abstract:Objective To explore the role of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3(NLRP3)inflammasome in the pathogenesis of dementia.Methods 16 patients with with Alzheimer's disease(AD),22 patients with vascular dementia(VD)and 20 healthy persons with similar age were detected the level of NLRP3 mRNA with RT-PCR in peripheral blood mononuclear cells January,2014 to October,2015.The serum level of interleukin(IL)-1β and IL-18 were detected with ELISA.The total number of white blood cells(WBC)and serum total calcium were collected.Single factor correlation analysis was performed between NLRP3mRNA and IL-1β,or IL-18,or WBC,or calcium concentration.Results The levels of NLRP3 mRNA ranged from high to low were as in AD group >VD group >the healthy group(q>11.48,P<0.05).The serum level of IL-1β was higher in AD group than in the the healthy group(q=16.74,P<0.05),but not significantly different between VD group and the healthy group,nor between VD group and AD group(P>0.05).There was no significant difference about IL-18 among AD group,VD group and the healthy group(P>0.05).NLRP3 mRNA was positively correlated with the serum levels of IL-1β(r=0.64)and calcium(r=0.58)in AD group.There was no correlation between NLRP3 mRNA and IL-18 or WBC(P>0.05).Conclusion The expression of NLRP3 inflammasome may be related with the pathogenesis of AD,but little impact on the pathogenesis of VD.

Key words:Alzheimer's disease;vascular dementia;nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3;inflammation;pathogenesis

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-01)

基金项目：1.国家自然科学基金项目(No.8156110223)；2.贵州省科技厅重大专项(No.黔科合计Z字2012-4010号)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.015

[中图分类号]R749.1

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2016)03-0306-04

作者单位：1.贵州医科大学第三附属医院，a.医学实验中心；b.神经内科；c.精神科，贵州都匀市558000；2.贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州贵阳市555000。作者简介：柏华(1964-)，男，汉族，湖南宁远县人，博士，教授，研究生导师，主要研究方向：老年性痴呆的发病机制和神经保护治疗。通讯作者：张启芳(1966-)，女，博士，教授。E-mail:baihcd@126.com(柏华),gracezhang886@hotmail.com(张启芳)。