培养基组成对松口蘑发酵醪中挥发性物质的影响

王 芳

（安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

松口蘑 ［Tricholoma matsutake（S.Ito et lmai）Sing］，又称松茸（日本）、松菇（朝鲜族）等，属担子菌亚门（Basidiomycota）、层菌纲（Hymenomycetes）、口蘑目（Tricholomatales，或伞菌目 Agaricales）、口蘑科（Tricholomaceae），口蘑属[1]（Tricholoma）。它生长于海拔1600～2600 m的温带和寒温带松树与栎树混交林带的林地。在国外主要分布于朝鲜、日本、美国、加拿大和北欧国家；在中国的主产区为东北地区和西南地区[2-4]。松口蘑菇体肥大、肉质鲜嫩、香味诱人，而且营养丰富，有“菇中之王”的美称[5]。目前，国内外较多集中在对松口蘑多样性分析[6]、RAPD反应体系的优化、产地生态环境调查及菌种分离繁殖[7]、培养技术开发、功能成分分析和评价等方面的研究。

食用菌的风味物质也是当前研究热点之一。如陈志杰等从灵芝菌丝体中检测出包括烯烃和醛类等在内的58种挥发性风味物质。何喆等采用顶空微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法分析，结果表明：液体培养樟芝菌丝体和固体培养樟芝菌丝体的挥发性化合物组成相似，仅各化合物的相对含量不同。松口蘑子实体中的香味成分已初步研究，我们前期较系统地分析了深层发酵法获得松口蘑发酵醪中所含的挥发性香味物质。

本研究通过深层发酵技术制备松口蘑菌丝体，并在优化了相关的培养基组成和培养条件下，采用顶空进样-固相微萃取技术收集松口蘑培养基及发酵后期挥发性香味成分，利用GC-MS技术对挥发性化合物进行全组分分析，获得不同培养基的松口蘑发酵醪中所含主要挥发性物质的种类和含量，并进行比较，为进一步培养和开发松口蘑香味物质的产品提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

松口蘑菌种由安徽丰原发酵技术工程研究有限公司菌种室提供。

1.2 培养基的配方

以葡萄糖，KH2PO4，MgSO4为基础培养基，添加不同组分配制100 mL培养基，见表1。

表1 各实验组不同培养基组成 g

1.3 接种

将超净台紫外灯打开灭菌30 min后关闭，每组接入2瓶菌种。摇瓶培养10 d，温度25℃，摇瓶转速160 r/min。

1.4 固相微萃取

松口蘑发酵10 d后，收集发酵醪，匀浆后取8 mL样品放入15 mL带聚四氟乙烯瓶盖的进样瓶，将初次使用的石英纤维萃取头在气相色谱的进样口老化至无杂峰，老化温度250℃，老化时间2 h；取5 mL处理后的样品，加入70 μL壬酸甲酯溶液作为内标，一起加入15 mL干净样品瓶中，用磁力搅拌器50℃下预热10 min，插入萃取头，先将萃取头鞘插入样品瓶中，推动手柄杆使萃取头伸出，萃取20 min后取出。

1.5 气相色谱-质谱的条件

1.5.1 气相色谱的条件 采用DB-1701色谱柱，柱长30 m，内径0.25 mm，厚度0.25 μm，高纯He流量1 mL/min，不分流，进样口温度250℃，解析20 min；起始温度35℃，保持5 min，以5℃/min上升至150℃，保持5 min，再以3℃/min升至240℃，保持20 min。

1.5.2 质谱条件 质谱接口温度280℃，离子源温度230℃，电离方式70 eV，扫描质量范围33～450 amu。数据收集用HP化学工作站软件对照NIST库进行，成分先由谱库初步鉴定，再结合化学成分的保留时间、质谱、实际成分和保留指数等进行定性。定量采用内标法相对定量。待萃取达平衡后，缩回萃取头，转移至气相色谱进样器中，推出萃取头解吸3 min，进行色谱分析。

2 结果与分析

采用固相微萃取技术收集接种前的培养基及接种后发酵醪挥发性香味成分，GC-MS法对挥发性化合物进行全组分分析，采用面积归一化法进行相对定量，松口蘑挥发性香味物质经GC-MS分析的结果见表2和表3。

由表2可知，接种前各组培养基中所含挥发性成分种类均较少，主要是4-硝基-4'-氯二苯砜，表明培养基本身对挥发性香味物质贡献不大。对比表2和表3中不同实验组发酵前后挥发性物质种类和含量的变化可以看出，发酵前1号培养基中，挥发性物质有2种，分别为4-硝基-4'-氯二苯砜和1，2-苯二甲酸-丁基-8-甲基壬基酯；而经10 d松口蘑发酵后，其发酵醪中有31种香味物质。2号培养基仅有一种挥发性成分，为1，2-苯二甲酸-丁基环己基酯；而发酵醪中共有28种香味物质，其中C16物质较多。发酵前3号培养基中含有3种挥发性物质，分别为1，2-苯二甲酸-丁基-8-甲基壬基酯、4-硝基-4'-氯二苯砜、己二酸-双（2-乙基己基）酯；其发酵醪中共有香味物质22种，以醇类及酯类较多，同时，培养基中挥发性物质均已被利用或转化，表明添加酵母膏之后有利于松口蘑的生长和代谢。而对比4号培养基发酵前后挥发性成分可以看出，发酵过程合成出28种香味物质，其中C16、C18化合物较多，而培养基中的4-硝基-4'-氯二苯砜已被利用或转化。发酵前5号和6号培养基中均含有邻苯二甲酸二异丁酯，而发酵后该成分经转化后浓度显著降低。7号培养基经发酵后共产出24种物质，含量均相对较高。而8号培养基经发酵后，产出24种挥发成分，培养基中的4-硝基-4'-氯二苯砜均已被转化。

表2 培养基挥发性物质

综合对比表3可以得知，7组培养基经发酵后均产有苯乙醇、2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）-2-环己烯-1-醇、4，4'（1-甲基亚乙基）双苯酚，可初步判定为松口蘑发酵主要香味物质。

结合表1的培养基组成和表3发酵后挥发性成分种类和含量可以看出，含有豆饼粉的1、2、3、4、5培养基发酵后都有D-苧烯，判断其为豆饼粉发酵特征物质。8号培养基中没有豆饼粉但其发酵醪有D-苧烯，推测为玉米浆、玉米粉、酵母膏三者混合后发生化学反应，产生某些与豆饼粉的相似成分。含有玉米浆的 1、3、5、6、8 培养基发酵后均产生环类化合物，故推测玉米浆与杂环化合物的形成有关。含有玉米粉的2、4、5、7、8培养基经发酵后，发酵醪中均含有癸醛，判断其为玉米粉发酵特征香味物质。1号培养基中没有玉米粉，发酵醪也产生癸醛，可能是从顺式-4-癸烯醛转化而来。

表3 各组培养基松口蘑发酵醪中挥发性香味物质的GC-MS分析结果

续表3

3 结论

本研究基于固相微萃取与气相色谱-质谱联用（GC-MS）法鉴定了不同培养基组成对松口蘑发酵醪挥发性成分的影响。其中，发酵前多数培养基中主要含有的挥发性成分为4-硝基-4'-氯二苯砜。培养基组成对松口蘑发酵醪的挥发性成分的种类和含量影响显著，其中，添加豆饼粉和玉米粉有利于苧烯和癸醛等挥发性成分的合成，而添加玉米浆有利于杂环化合物类挥发性成分合成。本研究为进一步了解食用菌挥发性香味物质合成和代谢途径提供一定的参考。

参考文献：

［1］卯晓岚.中国经济真菌［M］.北京：科学出版社，1998：328.

［2］廖丽娟，金光洙.松茸的化学成分及其药理作用的研究进展［J］.中国野生植物资源，2010，29（1）：12-14.

［3］Cho I H，Namgung H J，Choi H K，et al.Volatiles and key odorants in the pileus and stipe of pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.）［J］.Food Chem，2008，106（1）：71-76.

［4］Cho I H，Lee S M，Kim Y S，et al.Differentiation of aroma characteristics of pine-mushrooms（Tricholoma matsrtake Sing.）of different grades using gas chromatographyolfactometry and sensory analysis ［J］.Food Chem，2007，55（6）：2323-2328.

［5］Cho I H，Choi H K，Kim Y S.Difference in the volatile composition of pine-mushrooms（Tricholoma matsrtake Sing.）according to their grades［J］.Food Chem，2006，54（13）：4820-4825.

［6］黄小菲，罗 强，丁 祥，等.西南地区不同产地松茸挥发性成分分析［J］.食品科学，2011，32（18）：171-175.

［7］Wood W F，Lefevre C K.Changing volatile compounds from mycelium and sporocarp of American matsutake mushroom，Tricholoma magnivelare［J］.Biochem Sys Eco，2007，35（9）：634-636.