Cd2+对三疣梭子蟹的毒性效应研究

宋国林，母昌考，李荣华，王春琳

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)



Cd2+对三疣梭子蟹的毒性效应研究

宋国林，母昌考*，李荣华，王春琳

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

摘要:本研究以三疣梭子蟹Portunus trituberculatus为研究对象，通过急性和亚急性暴露试验，研究Cd(2+)对其肝胰腺和鳃的毒性效应。结果表明：Cd(2+)对三疣梭子蟹的48、72和96 h半致死质量浓度分别为6.55、4.33和3.12 mg/L，Cd(2+)对三疣梭子蟹的安全质量浓度为0.31 mg/L；在安全质量浓度和渔业水质标准质量浓度(<0.005 mg/L)下，随着暴露时间的延长，三疣梭子蟹的肝胰腺和鳃中HSP70的表达量都出现“先升后降”的趋势，与对照组相比，鳃中HSP70的表达量比肝胰腺的变化明显。在安全质量浓度以下，三疣梭子蟹的存活率并没有明显的变化，但是HSP70的诱导表达反映机体受到Cd(2+)的胁迫。因此HSP70基因可用作低质量浓度Cd(2+)污染检测的生物标志物。

关键词:三疣梭子蟹；Cd(2+)；急性毒性实验；HSP70

0引言

重金属污染是渔业环境污染的公害之一。重金属镉是一种废水中常见的污染物，当水中含Cd2+0.1 mg/L时，就会抑制地面水的自净作用[1]，对生物体的危害较大，可引起生物肝脏、泌尿系统等的功能变化，同时Cd2+还具有环境雌激素及环境内分泌干扰物质的效应[2]。三疣梭子蟹Portunustrituberculatus是一种重要的海洋经济动物，隶属甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，是中国沿海的重要经济蟹类。因其经济价值高、营养丰富、生长快等优点，已成为目前我国沿海重要的海水养殖品种之一[3]。热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物体在环境因子刺激作用下发生热休克反应(heat shock response, HSR)时启动合成的一类蛋白。这类蛋白质通过修复、重折叠变性蛋白以及解离聚集的蛋白，最终达到对细胞和机体的保护作用[4]。而HSP70是热休克蛋白家族的重要成员，它在进化上高度保守，作为主要的分子伴侣蛋白协助新生多肽的折叠、转运以及变性蛋白的修复和重折叠等，而且它在细胞保护、抗凋亡以及免疫治疗等方面有独特复杂的生物学功能。

传统的海洋污染物监测方法主要是通过检测水体和沉积物中污染物的形态和含量[5]，或是通过评价污染物对生态系统的宏观影响来实现，并不能阐明生物体对这些胁迫作用的生理反应和机能变化。此外，低质量浓度的污染物可能在生态系统层面上没有明显变化，但却能够在生物的细胞或分子水平上有所反映，而这种变化依靠传统的监测手段并不易检出。本研究以三疣梭子蟹为研究对象，通过急性和亚急性暴露实验，通过半致死质量浓度和HSP70的相对表达量研究Cd2+对其肝胰腺和鳃的毒性效应，为建立基于三疣梭子蟹响应特征的典型海洋污染物检测技术体系奠定基础。

1材料与方法

1.1实验材料及条件

试验用三疣梭子蟹来自浙江宁波鑫亿鲜活水产有限公司养殖场，平均体质量30.67±4.12 g，平均甲长4.15±0.51 cm，平均甲宽(全甲)8.32±1.34 cm。实验容器为100 L的聚乙烯塑料水槽。实验前在桶中暂养5 d，每天定时投喂新鲜的野杂鱼，实验前停食1 d。实验用水为二级沙滤海水，pH为8.2±0.31，盐度为23.3±2，水温为23±1 ℃。CdCl2·25H2O(AR)用蒸馏水按Cd2+质量浓度配成10 mg/L的母液使用。

1.2方法

1.2.1急性毒性实验

急性毒性实验参照《鱼类急性毒性试验方法》[6]，在预试验中，以10倍级差配制5个质量浓度组(0，0.1，1，10和100 mg/L)的CdCl2，对三疣梭子蟹处理24 h，得出Cd2+的100%致死质量浓度和0致死质量浓度。然后在此质量浓度范围内设置了5个质量浓度梯度，分别为2，4，6，10和20 mg/L，每个质量浓度设置3个平行，每个平行组放15只蟹，并设置对照组，实验持续96 h。试验过程中随时捞出死亡个体，观察并记录三疣梭子蟹中毒后的症状以及48，72和96 h死亡个体数。判断死亡的标准是对外界刺激无反应，放入到自然海水中不能复活。

1.2.2Cd2+胁迫对三疣梭子蟹HSP70基因表达的影响

依据渔业水质标准(Cd2+<0.005 mg/L)和急性毒性实验结果(SC=0.31 mg/L)，Cd2+质量浓度设置为3个质量浓度梯度和1个空白对照，分别为0，0.005，0.015和0.3 mg/L，每一梯度设3个平行，每个平行组放15只蟹，分别在2，4，8，12和24 h取2只蟹的鳃和肝胰腺，液氮保存。各组织在液氮中研磨后按Trizol法提取总RNA，在确认RNA完整后反转成cDNA，反转录完成后于-20 ℃保存。

采用实时荧光定量PCR检测三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中HSP70基因的表达情况，HSP70基因和内参β-actin基因的PCR引物根据文献[7]中的引物进行设计。HSP70引物为P1(5′-CCGTATCCCTAAGACCCAGAAA-3′)和P2(5′-CAGCCTCAGACTTATCA CCACAAA-3′)；β-actin引物为P3(5′-TCACACACTGTCCCCATCTACG-3′)和P4(5′-ACCACGCTCGGTCAGGATTTTC-3′)。采用Eppendorf Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪进行基因表达检测，并设立空白对照。试验所用体系为SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司)。反应体系为10 μL，即5 μL SYBR Green Master Mix Ⅱ，2 μL cDNA(100 ng/μL)模板，0.2 μL ROX Reference Dye(50×)，引物各0.4 μL(包括β-actin和HSP70)，2 μL ddH2O，同时设立空白对照组。PCR反应条件为：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;进行40个循环。反应结束后，按2-△△CT方法[8]进行结果计算。

1.3数据分析及公式

数据分析采用Excel和SPSS 13.0软件，采用probit回归求得48，72及96 h的半致死质量浓度(LC50)和相应时间下的95%置信区间，由公式:SC=96hLC50×0.1计算出安全质量浓度(SC)。采用单因素方差分析的Duncan多重比较法对转录组结果进行组间差异显著性检验，P<0.05为差异显著。

2结果与分析

2.1急性毒性实验结果

2.1.1三疣梭子蟹对Cd2+暴露的反应

三疣梭子蟹中毒后，会发生一系列变化。开始时表现为躁动不安，四处乱爬，逐渐头胸甲颜色会发黄，活力逐渐下降，到最后变得僵硬。Cd2+的质量浓度越高症状越明显，出现的时间越早。

2.1.2Cd2+对三疣梭子蟹的半致死质量浓度

Cd2+暴露后，除了对照组外，其余各组均出现死亡。并且死亡率随着Cd2+质量浓度的增加与实验时间的延长而提高，呈现较为明显的剂量-效应和时间-效应关系。计算得到48 h的LD50为6.55 mg/L，95%置信区间为4.78～9.03 mg/L；72 h的LD50为4.33 mg/L，95%置信区间为3.05～5.91 mg/L；96 h的LD50为3.12 mg/L，95%置信区间为2.11～4.34 mg/L，SC为0.31 mg/L(表1)。

2.2Cd2+胁迫对三疣梭子蟹HSP70表达的影响

2.2.1Cd2+胁迫对三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表达的影响

Cd2+暴露后，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表达呈现出先升高再降低的趋势(图1)，Cd2+质量浓度越高，这种趋势越明显，Cd2+质量浓度为安全质量浓度(SC=0.3 mg/L)时，HSP70在4 h表达量最高，为对照组的6倍，与其他各组均表现出显著差异(P<0.05)，随后持续下降，至24 h降至初始水平。Cd2+质量浓度为1/20SC(0.015 mg/L)时，HSP70的表达量在2～8 h显著高于对照组(P<0.05)，在4 h达到峰值，高出对照组2倍。在渔业水质标准下(Cd2+质量浓度为0.005 mg/L)，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表达量仍然表现为先上升后下降，在12 h达到最大值，此时表达量显著高于对照组(P<0.05)，几乎达到了安全质量浓度下的表达量(P>0.05)。

表1　Cd2+对三疣梭子蟹急性毒性实验结果

图1　不同暴露时间下三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表达量Fig.1　Transcription of HSP70 gene in hepatopancreas of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

2.2.2Cd2+胁迫对三疣梭子蟹鳃中HSP70表达的影响

在Cd2+胁迫下，三疣梭子蟹鳃中HSP70的表达量变化趋势与肝胰腺中相似，也呈现出先升高再降低的趋势(图2)。初始阶段(2 h)，各质量浓度下HSP70的表达量与对照组均没有显著差异(P>0.05)。随后各处理组的表达量均出现不同程度的增加，在4 h，安全质量浓度组(SC=0.3 mg/L)三疣梭子蟹鳃中HSP70的表达量远高于对照组和渔业水质标准组(Cd2+质量浓度为0.005 mg/L)，与1/20SC组(0.015 mg/L)也存在显著差异(P<0.05)。在8 h，除对照组外，其余各组HSP70的表达量均增加，且组间差异显著(P<0.05)。12 h后进入下降阶段，除了渔业水质组HSP70的表达量与对照组相似，其余两组仍与对照组间存在显著差异(P<0.05)。

图2　不同暴露时间下三疣梭子蟹鳃中HSP70表达量Fig.2　Transcription of HSP70 gene in gill of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

3讨论

3.1Cd2+对三疣梭子蟹的半致死质量浓度和安全质量浓度

镉是水迁移性元素，除了硫化镉外，其他镉的化合物均能溶于水，是《污水综合排放标准》中的第一类污染物，在自然界中常以化合物状态存在，一般含量很低，不会影响人体健康。当环境受到Cd2+污染后，Cd2+可在生物体内富集，通过食物链进入机体引起慢性中毒[9]。本研究结果表明，在高质量浓度Cd2+(2～20 mg/L)胁迫下，三疣梭子蟹的死亡率随着Cd2+质量浓度的增大和时间的延长而递增。呈现较为明显的剂量-效应和时间-效应的关系。Cd2+对三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死质量浓度分别为6.55，4.33和3.12 mg/L，理论安全质量浓度为0.31 mg/L。Cd2+对菲律宾蛤仔Ruditapesphilippinarum48，72和96 h的半致死质量浓度分别为11.15，7.58和4.74 mg/L[10]，鲤鱼Cyprinuscarpiocarpio幼鱼Cd2+的96 h半致死质量浓度为2.51 mg/L[11]， Cd2+对可口革囊星虫Phasolosmaesculenta的48和96 h半致死质量浓度分别为501和175 mg/L[12]。采用本文中的安全质量浓度算法，可以得出Cd2+对菲律宾蛤仔，鲤鱼幼鱼和可口革囊星虫的理论安全质量浓度分别为0.47，0.25和17.5 mg/L，相比之下，三疣梭子蟹对Cd2+的耐受性介于双壳类和鱼类之间。一般在实验和养殖水质管理中测得的Cd2+质量浓度比底泥中的要低[5]，三疣梭子蟹为底栖生物，在池塘养殖中接触到的实际质量浓度可能会高于水中测定结果，因此。在制定三疣梭子蟹的养殖规范时，应将Cd2+质量浓度要求定得更低。

3.2Cd2+对三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表达的影响

HSPs广泛存在于从原核生物到哺乳动物的整个生物界，是进化上高度保守、功能上至关重要的一类蛋白[13]。正常情况下，HSPs的表达量较少，主要起到分子伴侣的作用。在应激条件下，HSP能够在细胞核和胞液之间转运，修复错误折叠蛋白，加快正常蛋白质合成以实现细胞功能的恢复，同时增强机体的应激耐受性，提高细胞生存率[14]。因此，环境胁迫会引起生物体的应激蛋白(HSPs)表达水平的提高[15]。HSP家族中的HSP70因在受到环境刺激时表达量最多且对环境刺激敏感而在环境胁迫研究中受到广泛关注。镉暴露能引起野生贻贝消化道内HSP70的表达量呈直线上升[16]。氯化镉诱导L929细胞株中HSP70的表达明显增高[17]，草虾Palaeomonetespugio受镉胁迫后HSP70的表达显著增加[18]。RAJESHKUMAR et al[19]发现受镉污染的遮目鱼Chanoschanos肝细胞内HSP70表达上升与水污染的程度有关。当甲壳动物受到胁迫时，肝胰腺是重金属积累的主要场所，在毒理学研究中，甲壳动物的肝胰腺常被用作检测的靶标器官[20]。因此，可以通过甲壳动物肝胰腺中HSP70的表达量来反应环境中Cd2+的污染情况。本研究中，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表达量受到Cd2+的影响，随时间变化先上升后下降，表现为倒“U”型趋势，并且效应与Cd2+质量浓度呈现正相关，这与上述文献中其他物种在Cd2+胁迫下HSP70表达增高的结论一致。在理论安全质量浓度(SC)时，HSP70表达量是对照组的6倍；在渔业水质标准要求质量浓度下，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表达量仍然显著高于对照组(P<0.05)，这说明低质量浓度的Cd2+仍能影响三疣梭子蟹肝胰腺HSP70基因的表达，因此，我们认为，渔业水质标准中Cd2+的允许质量浓度还需要降低。

3.3Cd2+对三疣梭子蟹鳃中HSP70表达的影响

重金属在水生生物体内的积累与分布与不同组织的生理功能密切相关，鳃是三疣梭子蟹最重要的呼吸器官和渗透压调节器官，也是外界污染物的早期靶点。卢敬让 等[21]报道过镉暴露导致中华绒螯蟹Eriocheirsinensis鳃组织和细胞结构的损伤。与肝胰腺相比鳃更早地接触到镉污染，鳃中含钙较多，钙元素和镉元素化学性质相似，具有相同的电荷数和相近的离子直径，镉离子可替代钙离子进入鳃中[22]。鳃中HSP70为了维持细胞内稳态，缓解机体受到的应激损伤，在鳃中大量表达。本研究中，三疣梭子蟹鳃中HSP70的表达量随时间呈现出先升高后降低的趋势。在镉胁迫下鳃中HSP70的表达量总体大于肝胰腺中，但对照组中HSP70表达量低于肝胰腺中，这可能是由于肝胰腺是三疣梭子蟹主要的解毒器官，在正常的代谢过程中会伴随产生活性氧，活性氧过度积累会影响细胞的正常呼吸，HSP70可抑制产生氧自由基的关键酶即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，又能提高内源性过氧化酶如SOD水平，从而加快氧自由基的消除[23]。肝胰腺作为营养物质的代谢中心，需要较强的抗氧化系统清除肝胰腺中的多余活性氧。

4结论

本文通过Cd2+对三疣梭子蟹急性和亚急性暴露试验分析，得出以下结论：

(1)Cd2+对三疣梭子蟹的毒性作用很强，在高质量浓度Cd2+胁迫下，呈现较为明显的剂量-效应和时间-效应关系。Cd2+对三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死质量浓度分别为6.55，4.33和3.12 mg/L，理论安全质量浓度为0.31 mg/L。

(2)在低质量浓度Cd2+胁迫下，利用高保守性分子HSP70检测发现，在国家渔业水质标准(<0.005 mg/L)时，仍能引起三疣梭子蟹HSP70的显著表达(P<0.05)。因此，从三疣梭子蟹养殖和食品安全的角度，渔业水质标准的Cd2+允许质量浓度需要进一步降低。

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Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus

SONG Guo-lin, MU Chang-kao*, LI Rong-hua, WANG Chun-lin

(SchoolofMarineSciences,NingboUniversity,Ningbo315211,China)

Abstract:In this study, acute and sub-acute experiments were conducted to elucidate the toxic effect of cadmium on Portunus trituberculatus. The results show that the median lethal dose of cadmium are 6.55, 4.33 and 3.12 mg/L for 48 h，72 h and 96 h respectively, and the safe concentration of this metal is 0.31 mg/L. As the extension of exposure time, the expressions of HSP70 in hepatopancreas and gill are increased at the beginning, and then decreased significantly under the safe concentration and fishery water quality standard. Compared with control group, the expression of HSP70 in gill is more obvious than that in hepatopancreas. Under the safe concentration, the survival rate of Portunus trituberculatus is not changed obviously, but the excessive expression of HSP70 reflects that the crab is stressed by Cd(2+) exposure, so HSP70 indicators can be reflected more sensitive than the median lethal concentration at low concentration of Cd(2+ )pollution.

Key words:Portunus trituberculatus；Cd(2+)；acute toxicity test；HSP70

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008

中图分类号:S917.4

文献标识码:A

文章编号:1001-909X(2016)01-0061-06

作者简介:宋国林(1991-)，男，甘肃秦安县人，主要从事水产动物健康养殖方面的研究。 E-mail：nbusgl@sina.cn*通讯作者:母昌考(1976-)，男，副教授，主要从事甲壳动物养殖方面的研究。E-mail：muchangkao@nbu.edu.cn

基金项目:宁波市重大科技攻关计划项目资助(2013C11017)；浙江省公益性技术应用研究计划资助(2011C33025)

收稿日期:2015-04-22修回日期:2015-10-11

宋国林，母昌考，李荣华，等. Cd2+对三疣梭子蟹的毒性效应研究[J]. 海洋学研究,2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.

SONG Guo-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua，et al. Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus[J]. Journal of Marine Sciences, 2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.