丁酸氯维地平注射乳剂中依地酸二钠的含量测定

赵亚绘，王彦竹，宋丽明，张赫然，王杏林，田　沛（1.天津医科大学研究生院，天津　300070；.天津药物研究院有限公司，释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津　300193）



丁酸氯维地平注射乳剂中依地酸二钠的含量测定

赵亚绘1，2，王彦竹2，宋丽明2，张赫然2，王杏林2，田沛1，2
（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津药物研究院有限公司，释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津300193）

摘要目的：建立测定丁酸氯维地平注射乳剂中微量依地酸二钠的高效液相色谱法。方法：采用Agilent ZORBAX Extend-C(18)柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱流动相A为0.66 %四丁基氢氧化铵溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相为甲醇-水（9∶1），流速为1.0 mL·min(-1)，进样量50 μL，检测波长为254 nm。结果：依地酸二钠峰不受辅料干扰，在8.04～80.37 μg·mL(-1)内线性关系良好（r=0.999 9），加样回收率为97.78%（n=9，RSD=0.62%），定量限0.402 μg，供试品中依地酸二钠含量分别为46.7 μg·mL(-1)、47.0 μg·mL(-1)、49.6 μg·mL(-1)。结论：该方法准确可靠、专属性强，可用于丁酸氯维地平注射乳剂中依地酸二钠的含量测定。

关键词丁酸氯维地平；注射乳剂；依地酸二钠；高效液相色谱法；含量

Determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion

ZHAO Ya-hui1,2,WANG Yan-zhu2,SONG Li-ming2,ZHANG He-ran2,WANG Xing-lin2,TIAN Pei1,2
（1．Graduate School，Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co.,Ltd.State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics,Tianjin 300193,China）

Abstract Objective:To establish an HPLC method for determination of tracing EDTA -2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.Methods:The determination was performed on Agilent ZORBAX Extend-C18 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)with gradient elution,mobile phase A was 0.66% tetrabutylammonium hydroxide solution-acetonitrile(3:1)(pH was adjusted to 6.5)，and mobile phase B was methanol-water(9:1),the flow rate was 1.0 mL·min-1and the injection volume was 50 μL and the detection wavelength was 254 nm.Results:EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion could be detected without excipients interfering.Calibration curve was linear range of 8.04-80.37 μg·mL-1(r=0.999 9),the average recovery rate was 97.78%(n=9,RSD=0.62%),and the limit of quantitation was 0.402 μg and the determination of EDTA-2Na in the three batches of tests were 46.7 μg·mL-1，47.0 μg·mL-1，49.6 μg·mL-1respectively.Conclusion:This method is accurate,reliable,exclusive,so it can be used for the determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.

Key words clevidipine butyrate;injectable emulsion;EDTA-2Na;HPLC;content

丁酸氯维地平（clevidipine butyrate）属L型短效二氢吡啶类钙通道阻滞剂，可选择性作用于动脉血管以实现精确降压[1-3]，临床常用其注射乳剂以减少药物的血管刺激性[4-5]，实际生产中常加入适量金属离子螯合剂EDTA-2Na以提高乳剂稳定性，但体内Ca2+易与其形成配合物引起骨钙流失或低血钙[6]，因此，对注射剂中EDTA-2Na含量进行监测至关重要。目前，中国药典仅收载了EDTA-2Na原料药的含量测定方法[7]，尚未收录注射液中EDTA-2Na的控制标准，通常认为注射液中EDTA-2Na安全有效浓度为5～100 μg·mL-1[8]。本试验建立了准确、方便、快速测定丁酸氯维地平注射乳剂中EDTA-2Na含量的高效液相色谱法，为该药质量控制提供参考依据。

1　材料与方法

1.1仪器与试药Agilent 1200高效液相色谱仪（配有四元泵、在线脱气机、自动进样器、UV检测器、ChemStation工作站，美国）；XS205电子分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；FE20 pH计（梅特勒-托利多公司，瑞士）。

丁酸氯维地平注射乳剂（批号：141110，141111，141112，规格50 mL:25 mg，自制），空白丁酸氯维地平注射乳剂（不加EDTA-2Na，规格50 mL:25 mg，自制）；EDTA-2Na对照品（纯度99.9 %，中国药品生物制品检定所），乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件及系统适用性色谱柱Agilent ZORBAX Extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A相为0.66%氢氧化四丁基铵溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相为甲醇-水（9∶1），梯度洗脱条件见表1，流速为1.0 mL·min-1，柱温35℃，检测波长254 nm，进样体积50 μL，理论板数按EDTA-2Na峰计算不低于3 000。

表1　梯度洗脱条件Tab 1 The condition of gradient elution

1.2.2对照品溶液配制取EDTA-2Na对照品适量，精密称定，加水制成约50 μg·mL-1的溶液。精密量取该溶液1 mL，置50 mL离心管中，加空白丁酸氯维地平注射液（不含EDTA-2Na）9 mL，混合均匀。精密加入混合液[异丙醇-正庚烷（8∶2）]10 mL振摇1 min，再加入25mL正庚烷振摇1min，于5000 r·min-1离心10 min，精密量取下层水相5 mL，置10 mL量瓶中，加入1.0 mL 0.08% Cu（NO3）2溶液，加水至刻度，制得50 μg·mL-1的对照品溶液。

1.2.3供试品溶液配制精密量取丁酸氯维地平注射液10 mL，置50 mL离心管中，按“1.2.2对照品溶液配制”项下自“精密加入混合液”起同法操作。

1.2.4方法专属性精密量取空白丁酸氯维地平注射液（不含EDTA-2Na）10 mL，置50 mL离心管中，按“1.2.2对照品溶液配制”项下自“精密加入混合液”起同法操作，制得空白溶液。分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液进样测定，记录色谱图。

1.2.5线性关系考察精密称定EDTA-2Na对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得1 mg·mL-1的对照品储备液。精密量取储备液2、3、5、7、8 mL置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。再精密量取配制好的800 μg·mL-1EDTA-2Na溶液1mL置于10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到200、300、500、700、800、80μg·mL-1的EDTA-2Na溶液。精密量取上述溶液1 mL，按“1.2.2对照品溶液制备”项下同法操作，以EDTA-2Na浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6耐用性试验分别改变流动相流速（1.1、0.9 mL·min-1）、柱温（32℃、38℃）、缓冲液pH（pH 6.4和7.0）、检测波长（250 nm、260 nm），其他条件不变，评估测定条件发生微小变动时测定结果不受影响的承受程度。

1.2.7定量限以信噪比10∶1对应浓度为定量限，取EDTA-2Na的对照溶液逐级稀释，各精密量取1mL，同“1.2.2对照品溶液配制”项下操作，记录色谱图。

1.2.8精密度试验按“1.2.2对照品溶液配制”项下制备对照品溶液，连续进样6次，计算RSD。

1.2.9重复性试验取丁酸氯维地平注射乳剂（141110批），按“1.2.3供试品溶液配制”项下制备6份供试品溶液，连续进样，计算RSD。

1.2.10稳定性试验取对照品溶液，分别于0、5、12和24 h测定EDTA-2Na峰面积。取供试品溶液，分别于0、4和16 h测定EDTA-2Na峰面积。

1.2.11回收率精密称取EDTA-2Na对照品适量，配制4.0、5.0、6.0 mg·mL-1的EDTA-2Na水溶液，分别精密量取100 μL上述溶液置于50 mL离心管中（即加入样品量的80%、100%和120%），量取丁酸氯维地平注射液10 mL，置50 mL离心管中，按“1.2.2对照品溶液配制”项下自“精密加入混合液”同法操作，制得回收液。每个浓度样品平行测3份，计算EDTA-2Na含量及回收率。

1.2.12供试品中EDTA-2Na含量测定取不同批号丁酸氯维地平注射液(141110、141111、141112)按“1.2.2供试品溶液配制”项下方法配制，平行3次测定EDTA-2Na含量。

2　结果

2.1方法专属性空白溶液、对照品溶液和供试品溶液进样测定结果见图1，结果表明EDTA-2Na峰不受其他组分干扰，该法专属性良好。

图1　专属性HPLC色谱图Fig1 Specificity tests for HPLC chromatograms

2.2线性关系考察结果以EDTA-2Na浓度（C）为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=8.7099C+6.8851（r＝0．999 9）。结果表明，在8.04～80.37 μg·mL-1范围内，EDTA-2Na浓度与峰面积线性关系良好。

2.3耐用性试验结果见图2。正常情况下EDTA-2Na保留时间约6.0 min，当流速为1.1 mL·min-1，EDTA-2Na出峰稍提前，流速0.9 mL·min-1时出峰稍延后，但均属合理范围且峰型基本不变；流动相pH为6.4和7.0时，EDTA-2Na与其它成分的分离效果较好，但低于6.4时EDTA-2Na峰与溶剂峰重合，保留时间显著增加；柱温及检测波长稍变动时，EDTA-2Na的保留时间及峰型均基本不变，且理论板数均大于5 000，因此，本法耐用性良好。

图2　方法的耐用性试验Fig2 The durability test

2.4定量限结果当对照品浓度为8.04 μg·mL-1时其信噪比约为10∶1，EDTA-2Na定量限为0.402μg。

2.5精密度试验结果对照品中EDTA-2Na平均含量为49.4 μg·mL-1，RSD为1.47 %，说明该法精密度良好。

2.6重复性试验结果141110批丁酸氯维地平注射乳剂中EDTA-2Na平均含量为46.8 μg·mL-1，RSD为0.07%，说明该法重复性良好。

2.7稳定性试验结果EDTA-2Na对照品溶液在室温条件下24 h内稳定，峰面积的RSD为0.7 %，EDTA-2Na供试品溶液在室温条件下16 h内稳定，峰面积的RSD为0.5 %，符合要求。

2.8回收率结果见表2。平均回收率为97.78%（RSD=0.62%,n=9）。

表2　加样回收试验结果(n=9)Tab 2 Results of recovery(n=9)

2.9供试品中EDTA-2Na含量测定结果3批丁酸氯维地平注射液（141110、141111、141112）中EDTA-2Na含量分别为46.7 μg·mL-1、47.0 μg·mL-1、49.6 μg·mL-1，均在含量限度范围内（5～100 μg·mL-1），符合辅料安全原则。

3　讨论

3.1回收率对定量的影响对照品及供试品溶液配制过程中异丙醇-正庚烷起到破乳及萃取作用，离心加速油水分层，以便准确量取溶有EDTA-2Na的水层，但实际操作中不可避免的有EDTA-2Na损失。直接以EDTA-2Na水溶液为对照的预试验存在回收率不足（低于90%）的问题，因此，在预试验基础上进行改进，先向对照品水溶液中加入空白丁酸氯维地平微乳，然后破乳萃取，使对照溶液与供试品溶液制备过程保持一致，以便利用外标法相对准确计算供试品中EDTA-2Na的实际浓度，该法准确度及回收率显著提高（97.78%，n=9，RSD=0.62%）。

3.2流动相pH选择及梯度条件优化EDTA合铜离子与等摩尔的氢氧化四丁基铵定量反应，流动相pH是该定量反应关键，酸度较大时，H+竞争性的结合EDTA合铜离子，使离子对作用减弱，峰型变差；流动相碱度较大时易减少色谱柱和液相系统使用寿命，因此，实验将流动相A相调至近中性，同时采用梯度洗脱充分、及时洗脱水相中残余的脂肪酸，弥补了传统等度洗脱柱效恶化，峰型拖尾等不足。

本试验采用优化的梯度洗脱结合全面的方法学验证，建立了可靠、高效、专属性强的测定丁酸氯维地平注射乳剂中微量EDTA-2Na的HPLC法，该法也为其他药品中EDTA-2Na含量监测提供了思路和依据。

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[8]欧洲药典.6.0版[S].2008:234

（2015-08-25收稿）

基金项目国家重大新药创制课题基金资助(2014ZX09507005- 001)

作者简介赵亚绘(1990-)，女，硕士在读，研究方向：药物制剂；通信作者:王杏林，E- mail:wangxl@tjipr.com。

文章编号1006－8147（2016）01-0073-03

中图分类号R927.2

文献标志码A