通天草提取物对大鼠肝纤维化的影响和机制

李　林　孙　超　郭　家　张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



·基础研究·

通天草提取物对大鼠肝纤维化的影响和机制

李林孙超郭家张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的探讨通天草提取物(AEWH)对CCl4诱导大鼠肝纤维化(LF)的影响和机制。方法SD大鼠随机分成对照组，模型组，治疗组(秋水仙碱0.001 g/kg)，AEWH高、中、低剂量组(AEWH 3、1.5、0.75 g/kg)。采用40% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射诱导LF大鼠模型。放射免疫法检测大鼠血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ型胶原(CⅣ)水平。生化分析法检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平。电子显微镜观察大鼠肝组织镜下形态结构并计算肝脏脏器指数。酶联免疫法检测肝脏中转化生长因子(TGF)-β1和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果与模型组比较，AEWH高、中剂量组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT和AST明显降低(P<0.05)，TP和ALB明显升高(P<0.05)，大鼠肝脏病理纤维化明显减轻，肝脏脏器指数明显降低(P<0.05)，肝TGF-β1和TNF-α明显降低(P<0.05)。结论AEWH可减轻CCl4诱导LF大鼠肝脏损伤，降低LF程度。AEWH治疗LF的机制与抑制大鼠肝脏TGF-β1和TNF-α表达有关。

〔关键词〕通天草提取物；肝纤维化；肿瘤坏死因子-α

乙型肝炎病毒〔1〕、长期大量饮酒等因素〔2〕可刺激肝巨噬细胞激活，进而分泌转化生长因子(TGF)-β1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，作用于肝星状细胞使其转化为肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，沉积于肝内而演化成肝纤维化(LF)〔3,4〕。细胞外基质的过度沉积与胶原组织的降解产物血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)等有关。LF伴有谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)异常，肝功能降低。目前LF治疗药物包括TGF-β1拮抗剂、环氧化酶抑制剂等，药物剂量过大有副作用，因此探寻多靶点、毒副作用小的祖国医药迫在眉睫。课题组前期研究表明通天草水提物(AEWH)可改善阿尔茨海默病(AD)小鼠海马白介素(IL)-1β〔5〕、保护AD大鼠脑组织〔6〕、改善AD大鼠海马结构〔7〕、改善学习记忆〔8〕、增强AD大鼠抗氧化能力〔9〕、上调AD大鼠海马5-羟色胺表达〔10〕、调节AD大鼠脑IL-6和TNF-α水平〔11〕，改善AD大鼠核转录因子-κB表达〔12〕。因此本实验拟探讨AEWH对LF大鼠模型的影响及机制。

1材料和方法

1.1药品和试剂秋水仙碱(西双版纳版纳药业有限责任公司，批号140808)。通天草由黑龙江中医药大学中医药研究院周忠光教授购买，田明教授制备成通天草提取物(AEWH)水煎剂、烘干后制备成干粉、-20℃冰箱保存。使用AEWH时需要加热，临时配制成溶液，给予大鼠灌胃治疗。血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ试剂盒，ALT、AST、TP和ALB试剂盒，肝组织TNF-α和TGF-β1酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所)，CCl4和其他试剂均为国产分析纯，由齐齐哈尔医学院张英博副主任医师提供。

1.2动物清洁级雄性健康SD大鼠，体重(240±30)g，黑龙江中医药大学实验动物中心李宝龙副主任提供，合格证：SCXK(黑)2013-004。

1.3仪器6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)，EM-1200EX型透射电镜(日本Jeol),CM1900冰冻切片机(Leica公司)，TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)，超净工作台(中国上海精密仪器仪表公司)等。

1.4LF模型复制实验参考文献〔13〕制备LF大鼠模型。制备过程：采用40% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射SD大鼠诱导LF大鼠模型，每周对大鼠注射2次，共8 w。通过大鼠尾静脉采血，检验大鼠血清学指标，确认LF大鼠模型制备成功。对照组采用同样方法腹腔注射等量100%橄榄油。

1.5动物分组与处理SD大鼠48只随机分成对照组，模型组，治疗组，AEWH高、中、低剂量组，每组8只。对照组、模型组灌胃等量生理盐水，治疗组灌胃秋水仙碱0.001 g/kg，AEWH高、中、低剂量组灌胃AEWH 3、1.5、0.75 g/kg，灌胃35 d。

1.6血清LF指标SD大鼠灌胃结束后禁食20 h，眼球采血，静置，分层，3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装，-80℃保存。按照试剂盒说明书采用放射性免疫法检测血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ水平。

1.7检测肝功能指标各组大鼠灌胃结束后禁食20 h，眼球采血，静置，2 500 r/min离心15 min，取上清，分装，-80℃冰箱保存。血清生化指标ALT、AST、TP和ALB分别按照试剂盒说明书进行操作。

1.8透射电镜观察肝组织实验结束后，心脏灌注150 ml生理盐水，然后再用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠肝部位、2.5%戊二醛固定、四氧化锇固定、脱水、包埋、切片等过程，透射电镜观察肝组织结构。

1.9测定肝脏脏器指数实验结束后，迅速断头处死各组大鼠，取材大鼠肝脏，电子天平称重，计算脏器指数。脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/体重(g)。

1.10检测肝组织TGF-β1和TNF-α大鼠灌胃结束后断头处死，超净工作台上取肝组织，生理盐水洗涤，剪碎，匀浆，静置，离心，取上清，分装，-80℃保存。6100型RT-雷杜酶标仪450 nm波长测定各孔吸光度(A)，根据标准曲线求得方程，计算肝组织TGF-β1和TNF-α含量。

1.11统计学分析采用SPSS19.0统计学分析软件行单因素方差分析。

2结果

2.1血清LF指标与对照组比较，模型组LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组、AEWH高中剂量组LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明显降低(P<0.05)，而AEWH低剂量组大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量改变不明显(P>0.05)。见表1。

2.2血清肝功能指标与对照组比较，模型组大鼠ALT和AST含量明显升高(P<0.05)，TP和ALB含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组、AEWH高、中剂量组LF大鼠ALT和AST含量明显降低(P<0.05)，TP和ALB含量明显升高(P<0.05)，而AEWH低剂量组大鼠血清ALT、AST、TP和ALB改变不明显(P>0.05)。见表2。

表1　AEWH对LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

表2　AEWH对LF大鼠血清ALT、AST、TP和

2.3透射电镜观察肝组织透射电镜观察可见对照组肝细胞的细胞质内线粒体丰富，线粒体未见肿胀，肝细胞核膜清晰；模型组肝细胞的线粒体减少，脂滴较多；治疗组、AEWH高、中剂量组肝细胞的细胞器比较丰富，脂滴较少，线粒体较少；AEWH低剂量组肝细胞糖原较多，脂滴较多。见图1。

A：对照组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：AEWH高剂量组；E：AEWH中剂量组；F：AEWH低剂量组图1　AEWH对LF大鼠肝细胞质超微结构的影响(透射电镜，× 16 500)

2.4肝指数与对照组比较，模型组LF大鼠肝指数明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组、AEWH高、中剂量组LF大鼠肝指数明显降低(P<0.05)，AEWH低剂量组大鼠肝指数改变不明显(P>0.05)。见表3。

表3　AEWH对LF大鼠肝指数的影响

2.5肝组织TGF-β1和TNF-α通过标准曲线求得TGF-β1的方程是Y=0.098 7X+ 0.112 6，R2=0.994 2；TNF-α的方程是Y=0.019 4X + 0.143 4，R2=0.982 0。与对照组比较，模型组LF大鼠肝组织TGF-β1和TNF-α明显升高(P<0.05)；与模型组比较，秋水仙碱组、AEWH高、中剂量组大鼠肝组织TGF-β1、TNF-α明显降低(P<0.05)，AEWH低剂量组大鼠肝组织TGF-β1、TNF-α改变不明显(P>0.05)。见表4。

表4　AEWH对LF大鼠肝组织TGF-β1、

3讨论

HA、LN、PCⅢ和CⅣ是细胞外基质的降解产物，实验结果表明，模型组胶原纤维增加，LF模型稳定。AEWH高中剂量可改善大鼠模型肝组织LF程度，减少肝细胞外基质，减少胶原的含量，而低剂量AEWH对LF指标的改善作用较小。

血清肝功能指标ALT、AST、TP和ALB可直接反映肝脏合成功能及储备能力，实验结果表明，模型组大鼠肝细胞破坏，存在肝细胞内的大量因子通过破坏的肝细胞膜进入到血清中，同时肝脏的合成功能和储备功能下降。AEWH高中剂量可改善肝细胞膜通透性，同时肝合成功能得到恢复，显示模型大鼠肝功能得到恢复，而低剂量AEWH对肝功能指标的改善效果较差。

透射电镜观察可见对照组肝组织结构正常。而模型组肝细胞的功能低下，防御和解毒的能力较弱，模型稳定。经过治疗后，AEWH高中剂量可改善LF大鼠模型的组织病变，低剂量AEWH治疗效果较差。

实验还测定了肝指数，评价肝组织的损伤程度。结果表明LF模型大鼠肝脏质量增加，提示LF模型大鼠肝组织损伤明显，出现肝组织代偿性增生。经过治疗后，AEWH高中剂量组LF大鼠肝指数降低，说明肝脏质量减轻，提示AEWH高中剂量可不同程度地增加对肝脏的保护作用。

机体在促LF因子TGF-β1和TNF-α作用下，刺激成纤维细胞增生，增加和合成胶原纤维，加速肝细胞之间的细胞外基质沉积，最终引起LF。实验结果表明，模型组成纤维细胞数量增加，肝细胞之间的细胞外基质增加，肝星状细胞大量增殖，提示LF大鼠模型稳定。AEWH高、中剂量可干扰成纤维细胞生成，减少肝星状细胞的增殖，减轻大鼠LF程度。 TGF-β1和TNF-α的变化趋势与LF指标及其肝功能指标的变化趋势相同，提示AEWH高、中剂量通过改善TGF-β1和TNF-α来治疗LF。

4参考文献

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〔2016-01-03修回〕

(编辑曲莉)

Effect of Aqueous extract from Waternut herb on liver fibrosis rats and its mechanism

LI Lin，SUN Chao，GUO Jia,etal.

Qiqihaer Medical University, Qiqihaer 161006，Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of Aqueous extract from Waternut herb (AEWH) against liver fibrosis induced by CCl4 in rats and their mechanism.MethodsSprague-Dawley rats were randomly divided into control，model，treatment (colchicine 0.001 g/kg)，AEWH high-, medial-, low-dose (AEWH 3, 1.5 and 0.75 g/kg) groups. Liver fibrosis model rat was induced by intraperitoneal injection of 40% CCl4 (1 ml/kg). The radioimmunoassay was used to determine hyaluronic acid (HA)，laminin (LN)，procollagen Ⅲ (PCⅢ) and Ⅳ collagen(CⅣ) levels in serum of rats. The biochemical analysis was used to determine alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，total protein (TP) and albumin (ALB) levels in serum of rats. After the treatment all animals were sacrificed, morphology of liver tissue was observed by optical electron microscopy to calculate the organ coefficients of liver. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied for detecting transforming growth factor (TGF)-β1 and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in the liver.ResultsCompared with the model group， HA，LN，PC-Ⅲ，CⅣ，ALT and AST in serum of rats were significantly decreased(P<0.05)；TP and ALB in serum of rats were significantly increased (P<0.05)；the liver pathological variations of fibrotic rats were obvious；organ coefficients of liver were significantly decreased (P<0.05)；TGF-β1 and TNF-α in the liver of rats were significantly decreased (P<0.05) in AEWH high-dose and medial-dose groups.ConclusionsAEWH could attenuate the CCl4-induced immunological liver injury and the fibrosis level in rats. The mechanisms possibly contribute to down-regulation expression of TGF-β1 and TNF-α in liver of rats.

【Key words】Aqueous extract from Waternut herb；Liver fibrosis；Tumor necrosis factor-α

〔中图分类号〕R285

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1537-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.001

通讯作者：张晓杰(1965-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事肝纤维化、抑郁症、痴呆研究。

基金项目：国家自然科学基金(81173576)；黑龙江省自然科学基金(H201354)；黑龙江省教育厅基金(12521624，12531788，12531790)

第一作者：李林(1978-)，男，讲师，硕士，主要从事肝纤维化、抑郁症、痴呆研究。