微生物酶催化的不对称还原反应合成(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇

杨　敏, 李　珂, 周晓建, 崔宝东, 陈永正

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563000)



·快递论文·

微生物酶催化的不对称还原反应合成(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇

杨敏, 李珂, 周晓建, 崔宝东, 陈永正*

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义563000)

摘要：以LB培养基培养Pseudomonas monteilii TA-5，将其整细胞作为生物催化剂(Cat)，催化4-苯基-2-丁酮(1)的不对称还原反应，对映选择性地合成了(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇。在最佳反应条件[1 10 mmol·L(-1)， c(Cat) 30 g cdw·L(-1)， 10%丙三醇，pH 8.0， 300 r·min(-1)，于30 ℃反应24 h]下，转化率82%， ee值91%。

关键词：生物催化； LB培养基； Pseudomonas monteilii TA-5； 不对称还原； (S)-(+)-4-苯基-2-丁醇； 合成

手性二级醇是许多药物的重要中间体和合成模块，其中(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇(2)为抗高血压药拉贝洛尔、丁苯碘铵，解痉镇痫剂依美溴铵的重要关键中间体(Chart 1)[1]。因此，研究该类化合物的不对称合成方法极为重要。目前，手性2的合成大多采用金属-手性配体催化酮的不对称还原[2-7]或者烯醇的异构化和不对称转移氢化串联反应[8]等方法来实现。近年来，科研工作者发现利用生物催化剂进行不对称还原的方法也可实现[9-14]。生物催化的不对称氧化还原反应合成手性药物中间体的方法越来越引起相关科研人员的关注[15-18]。

本课题组研究[19]发现，PseudomonasmonteiliiTA-5在M9培养基中以甲苯为诱导碳源进行菌株培养，可实现4-苯基-2-丁酮(1)苄位亚甲基的不对称羟基化反应，获得(R)-3-羟基-4-苯基-2-丁酮，对映选择性达99%，且未检测到羰基还原产物2的产生。本文以LB培养基培养PseudomonasmonteiliiTA-5，将其整细胞作为生物催化剂(Cat)，催化1的不对称还原反应，对映选择性地合成了2(Scheme 1),其结构经1H NMR和13C NMR确证。并对催化反应条件进行了优化。

Scheme 1

1实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 400 MHz型核磁共振仪；SHIMADZU LC-20A型正相高效液相色谱仪[色谱柱：CHIRALCEL OD-H(4.6 mmΦ×250 mm, 5 μm)；流动相:95%正己烷/5%异丙醇；流速:0.5 mL·min-1；分析时间:35 min；检测波长:210 nm, tR=22.2 min, tS=33.6 min]； BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜；FE20型pH酸度计；Multiskan Spectrun型全波长酶标仪。

PseudomonasmonteiliiTA-5，自制；氯化钠(99.5%)，氯化铵(99.5%)，磷酸二氢钾(99%)和十二水磷酸氢二钠(99%)，百灵威科技公司；酵母浸粉，蛋白胨，琼脂，OXOID；其余所用试剂均为分析纯。

1.2合成

(1) 细胞培养

称取胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g和氯化钠10.0 g，用适量重蒸水溶解，混匀，定容至1 000 mL，并调至pH 7.0。取10 mL分装于20 mL螺口瓶中；另取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，于121 ℃灭菌30 min得LB培养基，备用。

将PseudomonasmonteiliiTA-5接种于20 mL螺口瓶的LB培养基中，标记为一级培养，在 30 ℃， 300 r·min-1条件下于摇床中培养7 h。取种子菌液2 mL于250 mL锥形瓶的LB培养基中，标记为二级培养，在30 ℃， 300 r·min-1条件下于摇床中培养17 h。将菌液取出并快速分装于已冰浴好的50 mL离心管中，用全波长酶标仪测量各管菌液的OD值。利用冷冻离心机(8 000 r·min-1，于4 ℃离心5 min)离心后倒掉上层液体。根据OD值与细胞浓度关系计算出应加入适量的Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，振摇使细胞与缓冲溶液混合均匀，制得c(Cat) 30 g cdw·L-1细胞溶液。

(2) 2的合成

配制反应液5 mL[c(Cat) 30 g cdw·L-14.5 mL， 10 mmol·L-11 7.62 μL， 丙三醇492.38 μL]，调至pH 7， 300 r·min-1，于30 ℃反应24 h[HPLC监测(在EP管内加入反应液850 μL，用乙酸乙酯850 μL萃取，漩涡振荡器振摇，使其充分混合。在10 000 r·min-1， 5 min， 4 ℃条件下离心。取上清液600 μL加入装有适量无水硫酸钠的EP管中，振摇，干燥。取上清液400 μL到HPLC样品瓶中，并加入400 μL含有2 mmol·L-1苯甲醇内标的乙酸乙酯溶液。根据内标物、底物和产物的峰面积，用内标法得到相应底物浓度、产物浓度，计算转化率、产率及ee值)]。合并50瓶反应液，用乙酸乙酯(3×200 mL)萃取，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，减压旋蒸后经柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶20]纯化得无色油状液体2 223.5 mg，转化率82%，ee值91%；1H NMRδ： 7.35(d,J=8.0 Hz, 3H), 7.29～7.23(m, 2H), 4.56(d,J=6.4 Hz, 3H), 3.82～3.86(m, 1H), 2.67～2.78(m, 2H), 2.01(s, 1H), 1.75～1.83(m, 2H);13C NMRδ： 142.1, 128.5, 125.9, 67.5, 40.9, 32.2, 23.6；其绝对构型用标准品经手性液相色谱对照鉴定(图1)。

2结果与讨论

2.1反应条件优化

为了探索最佳反应条件，考察了反应时间、细胞浓度、底物浓度、pH和辅助溶剂对1的不对称还原反应的影响。

Time/min

(1) 反应时间

反应液5 mL,c(Cat) 50 g cdw·L-1，其余反应条件同1.2(2)，考察反应时间对不对称还原反应的影响，结果见图2。

Time/h

由图2可见，其反应时间达6 h时转化率的曲线已基本平稳，即在反应6 h后底物已基本不再转化为产物；而反应时间从40 min至24 h时，其产物对映选择性变化不大，ee值均为91%～92%。由于在实际反应过程中生物催化剂的不稳定性，6 h反应结果的重现性较差，而24 h反应结果重现性较好。因此，最佳反应时间确定为24 h。

(2)c(Cat)

1 5 mmol·L-1，反应时间24 h,其余反应条件同2.1(1)，考察c(Cat)对不对称还原反应的影响，结果见表1。由表1可见，c(Cat)对产物对映选择性的影响不明显；当c(Cat)为30 g cdw·L-1时，转化效果较好(转化率52%，ee值90%)。因此最佳c(Cat)为30 g cdw·L-1。

表1　c(Cat)对不对称还原反应的影响*

*1 5 mmol·L-1，反应时间24 h,其余反应条件同2.1(1)。

(3)c(1)

反应时间为24 h,其余反应条件同2.1(1)，考察c(1)对不对称还原反应的影响，结果见表2。由表2可见，随着c(1)增大，转化率增加，可能是因为c(1)在一定范围内的增加导致反应中酶与底物接触的几率有所增大，从而使反应速率提高而得到较高的转化率。因此，最佳的c(1)为10 mmol·L-1。

表2　c(1)对不对称还原反应的影响*

*反应时间24 h,其余反应条件同表1。

(4) pH

反应时间为24 h,其余反应条件同2.1(1)，考察反应体系pH对不对称还原反应的影响，结果见表3。由表3可见，当pH逐渐升高时，ee值变化不大(90%～92%)；但转化率随着pH的增高而逐渐增加，且pH 8.0时，转化率达到最大值(69%)。

表3　pH值对不对称羟基化反应的影响*

*反应时间24 h,其余反应条件同表1。

(5) 辅助溶剂

当加入少量的有机溶剂时，可以提高底物在水中的浓度，增加底物与酶反应的接触面，提升反应的转化率[20]。反应时间24 h,其余反应条件同2.1(1)，考察辅助溶剂对不对称还原反应的影响，结果见表4。由表4可见，采用亲水性较强的有机溶剂丙三醇为辅助溶剂时，ee值提高至93%，而转化率也有了较大的提升。因此，辅助溶剂确定为丙三醇。

表4　辅溶剂对不对称羟基化反应的影响

*反应时间24 h,其余反应条件同表1。

综上所述，最佳还原反应条件为：反应液5 mL,细胞浓度为30 g cdw·L-1，底物浓度10 mmol·L-1， 10%(体积百分数)丙三醇为辅溶剂，pH 8.0， 300 r·min-1，于30 ℃反应24 h，转化率82%，ee值91%。

以LB培养基培养的PseudomonasmonteiliiTA-5催化还原4-苯基-2-丁酮，合成了(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇。该方法具有高效，高选择性，专一性强，反应条件温和，环境友好等特点，为手性二级醇的合成提供了一个新的思路。

参考文献

[1]Bracher F, Litz T. Building blocks for the preparation of enantiomerically pure drugs containing a phenylalkylamine moiety[J].Arch Pharm,1994,327:591-593.

[2]Kuwano R, Uemura T, Saitoh M,etal. A trans-chelating bisphosphine possessing only planar chirality and its application to catalytic asymmetric reactions[J].Tetrahedron:Asymmetry,2004,15:2263-2271.

[3]Hosoda N, Kamito H, Takano M,etal. Synthesis of chiral 2-(anilinophenylmethyl) pyrrolidines and 2-(anilinodiphenylmethyl)pyrrolidine and their application to enantioselective borane reduction of prochiral ketones as chiral catalysts[J].Tetrahedron,2013,69:1739-1746.

[4]Ghoshal A, Sarkar A R, Manickam G,etal. Rhodium-catalyzed asymmetric hydrosilylation of ketones employing a new ligand embodying the bis(oxazolinyl)pyridine moiety[J].Synlett,2010,10:1459-1462.

[5]He P, Liu X H, Zheng H F,etal. Asymmetric 1,2-reduction of enones with potassium borohydride catalyzed by chiralN,N'-dioxide-scandium(III) complexes[J].Org Lett,2012,14(19):5134-5137.

[6]Inagaki T, Ito A, Ito J,etal. Asymmetric iron-catalyzed hydrosilane reduction of ketones:Effect of zinc metal upon the absolute configuration[J].Angew Chem Int Ed,2010,49:9384-9387.

[7]Imamoto T, Itoh T, Yamanoi Y,etal. Highly enantioselective hydrosilylation of simple ketones catalyzed by rhodium complexes of P-chiral diphosphine ligands bearing tert-butylmethylphosphino groups[J].Tetrahedron:Asymmetry,2006,17:560-565.

[8]Slagbrand T, Lundberg H, Adolfsson H. Ruthenium-catalyzed tandem-isomerization/asymmetric transfer hydrogenation of allylic alcohols[J].Chem Eur J,2014,20:16102-16106.

[9]Nakamura K, Fujii M, Ida Y. Stereoinversion of arylethanols byGeotrichumcandidum[J].Tetrahedron:Asymmetry,2001,12:3147-3153.

[10]Nakamura K, Takenaka K, Fujii M,etal. Asymmetric synthesis of both enantiomers of secondary alcohols by reduction with a single microbe[J].Tetrahedron Letters,2002,43:3629-3631.

[11]Matsuda T, Harada T, Nakamura K. Alcohol dehydrogenase is active in supercritical carbon dioxide[J].Chem Commun,2000：1367-1368.

[12]Patel J M, Musa M M, Rodriguez L,etal. Mutation of thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase at Trp-110 affects stereoselectivity of aromatic ketone reduction[J].Org Biomol Chem,2014,12:5905-5910.

[13]Voss C V, Gruber C C, Faber K,etal. Orchestration of concurrent oxidation and reduction cycles for stereoinversion and deracemisation of sec-alcohols[J].J Am Chem Soc,2008,130:13969-13972.

[14]Musa M M, Phillips R S, Laivenieks M,etal. Racemization of enantiopure secondary alcohols by thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase[J].Org Biomol Chem,2013,11:2911-2915.

[15]Zhuo J R, Chen Y Z. Research progress on asymmetric oxidation of sulfides with biocatalysts[J].Chin J Syn Chem,2015,23(5):456-460.

[16]Chen Y Z, Tang W L, Mou J,etal. High-throughput method for determining the enantioselectivity of enzyme-catalyzed hydroxylations based on mass spectrometry[J].Angew Chem Int Ed,2010,49:1-8.

[17]Wu S K, Chen Y Z, Xu Y,etal. Enantioselective trans-dihydroxylation of aryl olefins by cascade biocatalysis with recombinant escherichia coli coexpressing monooxygenase and epoxide hydrolase[J].ACS Catal,2014,4:409-420.

[18]Paul C E, Tischler D, Riedel A,etal. Nonenzymatic regeneration of styrene monooxygenase for catalysis[J].ACS Catal,2015,5:2961-2965.

[19]Chen Y Z, Lie F, Li Z,etal. Enantioselective benzylic hydroxylation with pseudomonas monteilii TA-5:A simple method for the syntheses of (R)-benzylic alcohols containing reactive functional groups[J].Adv Synth Catal,2009,351:2107-2112.

[20]Griebenow K, Vidal M, Baéz C,etal. Nativelike enzyme properties are important for optimum activity in neat organic solvents[J].J Am Chem Soc,2001,123:5380-5381.

Asymmetric Synthesis of (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol by Carbonyl Reduction with Microbial Enzymes

YANG Min,LI Ke,ZHOU Xiao-jian,CUI Bao-dong,CHEN Yong-zheng*

(School of Pharmarcy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China)

Abstract：Pseudomonas monteilii TA-5 cultivated with LB medium was employed as the biocatalysts(Cat) for the synthesis of (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol with high enantioselectivity by asymmetric reduction. In this paper, the optimal reaction conditions for bioreduction of 4-phenyl-2-butanone(1) were optimized. Under the optimized reaction conditions[1 10 mmol·L(-1), c(Cat) 30 g·cdw·L(-1), 10% glycerol as the cosolvent, pH 8.0, 300 r·min(-1), at 30 ℃ for 4 h], the conversion was 82% and ee was 91%.

Keywords：biocatalysis; LB medium; Pseudomonas monteilii TA-5; asymmetric reduction; (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol; synthesis

中图分类号：O623．42； O621．3

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.03.16009

作者简介：杨敏(1991-)，女，苗族，贵州台江人，硕士研究生，主要从事生物催化的研究。通信联系人： 陈永正，教授， Tel. 0851-28642336， E-mail： yzchen@zmc.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21262051)； 贵州省教育厅自然科学项目(黔教科2011-046号)

收稿日期：2015-12-29