热回流提取法测定不同产地角茴香中总生物碱的含量

张宝琦， 张 琳， 关舒丹， 赵 龙， 杨 波， 陈 宾(.承　德　医　学　院　附　属　医　院， 河北 承德 067000 .承德医学院中药研究所， 河北 承德 067000 .承德医学院社会科学部美育教研室， 河北 承德 067000)



热回流提取法测定不同产地角茴香中总生物碱的含量

张宝琦1， 张 琳2， 关舒丹3， 赵 龙1， 杨 波1， 陈 宾1
(1.承德医学院附属医院， 河北 承德 067000 2.承德医学院中药研究所， 河北 承德 067000 3.承德医学院社会科学部美育教研室， 河北 承德 067000)

【摘 要】目的:确定热回流法提取角茴香中总生物碱的最佳提取工艺，并测定不同产地角茴香中总生物碱的含量，为角茴香的质量标准提供一定的依据。方法:采用酸性染料比色法测定不同产地的角茴香中总生物碱的含量，通过正交设计方法，以总生物碱的得率为考察指标，优选总生物碱的提取工艺。结果:最终确定总生物碱的最佳提取工艺为:用0.01moL/ L的盐酸热回流提取4次，每次2h，料液比为1:20。结果表明，2014年采自青海湟中的角茴香中所含生物碱含量最高，2015年采自青海大通的含量最低。结论:不同产地的角茴香中总生物碱的含量差异较大。通过优选得到的提取工艺提高了生物碱的提取效率，可做为今后角茴香中总生物碱的提取工艺。建立的角茴香中总生物碱含量测定方法简便、结果准确可靠。

【关键词】角茴香； 总生物碱； 热回流提取法； 含量测定

角茴香(Hypecoum erectum L.)又名山黄连、野茴香，为罂粟科(Papaveraceae)植物直立角茴香的根或全草[1]，生于干燥山坡、草地、沙地、砾质碎石地[2]。产于内蒙古、河北、青海、山西、新疆、西藏等地。春季开花前挖根及全草，晒干。具有良好的清热解毒，镇咳止痛等药理作用[3，4]。其主要化学成分是生物碱类化合物[5]，全草含角茴香碱(hypecorine)，角茴香酮碱(hypecorinine)，原阿片碱(protopine)，黄连碱(coptisine)，隐品碱(cryptopine)、α-别隐品碱(α-allocryptopine)，别隐品碱(allocryptopine)，刻叶紫堇胺(corydamine)，左旋的N-甲基四氧小檗碱(N-methylcanadine)，直立角茴香碱(hyperectine)，异直立角茵香碱(isohyperectine)等。韦佩涛[6]采用超声辅助提取细果角茴香中总生物碱，并考察了细果角茴香总生物碱的抑菌活性。苏银芬[7]等采用柱层析、薄层层析、薄层制备以及重结晶等现代化学分离纯化技术，核磁共振、质谱等波谱解析技术对角茴香地上部的生物碱进行了分离纯化和结构鉴定，从角茴香地上部分离纯化得到了7个生物碱，并测定了其抑菌活性。但通过热回流提取法对角茴香总生物碱的提取工艺及含量测定目前没有相关报道，本文采用热回流提取法对角茴香总生物碱进行提取，并通过设计正交试验选择最佳提取工艺，同时采用酸性染料比色法对其进行了含量测定，并对六个不同产地角茴香中的生物碱含量进行了分析，以期为今后角茴香中的质量评价提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 仪器:AG-245电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Hp-8453紫外可见分光光度计(惠普公司)；RE-5299旋转蒸发仪(上海普渡生化科技有限公司)；H.H.S21.6电热恒温水浴锅(上海医疗器械三厂)。

1.1.2 试剂:溴甲酚绿(化学纯，购买于天津化学试剂研究所)；罂粟碱(对照品，购买于中国食品药品检定研究院，纯度为98.8%)；氯仿(化学纯，购买于天津市鑫源化工有限公司)；苯二甲酸氢钾(分析纯，购买于天津市福晨化学试剂厂)；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 药材:角茴香植物:2014年采自青海省湟中；2014年采自青海省互助，2014年采自青海省湟源，2015年采自青海省大通宝库，2015年采自青海省贵德，2015年采自青海省祁连。经由承德医学院中药研究所赵春颖副研究员鉴定为鉴定为罂粟科角茴香属角茴香(Hypecoum erectum L.)，样品自然风干，粉碎备用。

1.2 方 法

1.2.1 提取方法:精确称取粉碎后的角茴香2g于圆底烧瓶中，用0.01moL/ L的盐酸，加热回流提取。得提取液，抽滤。然后用5%的碳酸钠溶液调PH至9～10。再用氯仿反复萃取，挥干氯仿，最后用10mL的0. 01moL/ L盐酸溶解，定容，即得供试液。

1.2.2 正交实验:选择料液比(A)，提取时间(B)，提取次数(C)为考查因素，以总生物碱含量(mg/ g)为测定指标，用L9(33)正交实验方法，确定角茴香中总生物碱提取的最佳工艺(见表1)。

表1　正交实验因素水平

1.2.3 含量测定

1.2.3.1 罂粟碱对照液的制备:精密称取干燥恒重的罂粟碱对照品，用0.01moL/ L的盐酸溶液溶解并定容至5mL，摇匀，再精密移取该溶液2.5mL用0.01moL/ L的盐酸溶液定容至10mL的容量瓶中，摇匀，即得浓度为50μg/ mL的罂粟碱对照液。

1.2.3.2 缓冲溶液的配制:取0.2moL/ L苯二甲酸氢钾溶液25mL与0.2moL/ L的盐酸溶液10.2mL混合于100mL容量瓶中，定容，摇匀，即得PH = 3的缓冲溶液。

1.2.3.3 酸性染料比色原理及溶液的配制:酸性染料比色法是利用某些酸性染料在一定PH条件下可与碱性药物结合，定量形成有色离子对，并定量被有机溶剂提取，然后用比色法测定其含量。取溴甲酚绿0.1g，加0.05moL/ L氢氧化钠溶液3.0mL使溶解，加水稀释至200mL，摇匀，即得。

1.2.3.4 吸收曲线的绘制:用移液管准确移取罂粟碱对照溶液1.2mL，按1.2.3.3项下方法用分光光度计在250～550nm的波长范围内进行吸光度的测定，结果在415nm处有最大吸收峰，故以此作为测定波长。

1.2.3.5 标准曲线的绘制:吸取罂粟碱对照液0.4、0. 8、1.2、1.6、2.0mL分别置于分液漏斗中，加PH=3的缓冲溶液5.0mL、溴甲酚绿2.0mL，摇匀，再加氯仿溶液16mL，充分振摇，静置1h，分取氯仿层测定吸光度，以0.01moL/ L盐酸1mL同法做空白对照。以罂粟碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘图，求得回归方程:y= 0. 0817x-0.0357，R=0.9998。

表2　正交实验结果

1.2.3.6 供试品中总生物碱的含量测定:按最优组合提取，得到供试液，精密移取各供试液0.2mL，按照1. 2.3.5项下方法，在波长415nm处测定吸光度，根据回归方程求得总生物碱含量。

2 结 果

2.1 正交试验:从正交实验结果表可知，7号实验结果最好，对应的最优组合为A3B1C3；由极差R分析可知，总生物碱提取条件因素的顺序为A>B>C。由正交条件的均匀可比性得知，各因素的最优水平组合为A3B2C3，即料液比1∶20，提取时间2h，提取次数4次。在此最佳条件下的验证性试验测得总生物碱含量为4. 00mg/ g。因此，采用热回流提取法，最终确定的最佳提取条件为:料液比1∶20，提取时间2h，提取次数4次。

2.2 含量测定:按最终确定的最佳提取条件，即最优组合A3B2C3进行提取，分别对不同产地角茴香中总生物碱含量进行测定，结果见表3。

表3　不同产地角茴香总生物碱含量

结果显示，其中总生物碱含量高低依次为14年采自青海省湟中，14年采自青海省互助，14年采自青海省湟源，15年采自青海省祁连，15年采自青海省贵德，15年采自青海省大通宝库。

3 讨 论

角茴香喜温暖、潮湿气候，产区多在北纬25度以南，年降水量需1000mm以上，相对湿度在80%以上。幼树喜荫，成年树喜光。忌强光和干旱，怕强风。以土层深厚、疏松、腐殖质含量丰富、排水良好的偏酸性的壤土或砂质壤土栽培为宜。而本研究药材采收之地:青海湟中、青海互助、青海湟源、青海祁连、青海贵德、青海大通在温度、湿度、气候、土壤质地均有不同，同时，六批药材分别采收于两年的同一采收期，但每年各地的气候也存在一定差异。这些因素都导致六批角茴香药材中总生物碱的含量有所差别。角茴香在临床中应用广泛、疗效可靠。本文通过优选所得到的提取工艺提高了角茴香生物碱的提取效率，同时建立的含量测定方法简单、结果准确可靠，可做为今后角茴香中总生物碱的提取工艺并进行含量测定。

【参考文献】

[1] 中国科学院西北高原生物研究所.藏药志[M].青海:人民出版社，1991.248.

[2] Can A，Jai X. An overview of pharmaceutical research on Hypecoum L. of Tibetan medicine [J]. Auhui Agric Sci，2011，39:8374～8375.

[3] Chen BZ，Fang QC. Chemical study on a traditional tibetan drug hypecoum leptocurpum[J].Acta Pharm Sin，1985，20: 658～661.

[4] 王国强.全国中草药汇编(卷二)[M].北京:人民卫生出版社，2014.551～552.

[5] 刘晓娟，魏红，杨娇，等.藏药细果角茵香醇提物对内毒素炎症小鼠的保护作用[J].苏州大学学报，2012，32(6): 754～759.

[6] 韦佩涛.细果角茴香生物碱最低抑菌浓度测定[J].安徽农业科学，2013，41(27):10986～10988.

[7] 苏银芬.角茴香地上部生物碱及其抑菌活性研究[D].西北农林科技大学，2011.

The Application of Heat reflux Extraction to Determine the Contents of Total Alkaloids in Erect Hypecoum Herb from Different Origins

ZHANG Baoqi， et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China)

【Abstract】Objective: To make sure that the optimum extraction technology of total alkaloids in erect hypecoum herb was heat reflux extraction method，to determine the contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins，and to provide a certain basis for the quality standard of hypecoum. Methods: The contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins were tested with acid dye colorimetry. By orthogonal design method，the yield of total alkaloids was referred as the index of evaluation tobook=638,ebook=114optimize its extraction process. Results: The optimum extraction technology of total alkaloid was finally that it was extracted 4 times with 0.01 moL/ L hydrochloric acid(HC) through the method of heat reflux，2 hours for each time，with material to solvent 1∶20. The results showed that the highest contents of total alkaloids in erect hypecoum herb collected from Huangzhong area of Qinghai Province in 2014，and the lowest from Datong area of Qinghai in 2015. Conclusion: There's a significant difference about the contents of total alkaloids in erect hypecoum herb from different origins. The optimized extraction process improved the extraction efficiency of alkaloid. And this method could be used as the extraction technology of total alkaloid from erect hypecoum herb in the future due to its simpleness，accurateness and reliability.

【Key words】Erect hypecoum herb； Total alkaloids； Heat reflux extraction； Content determination

通讯作者:陈 宾，E-mail:drchenbin@ vip.sina.com

【基金项目】河北省教育厅2015年省级研究生创新资助项目，(编号:z2015052323)；国家自然科学基金，(编号:81502334)；国家卫计委吴阶平专项基金，(编号:320.6750.14119)；河北省卫生厅科研基金项目，(编号:ZL20140116)

【文章编号】1006-6233(2016)04-0637-04

【文献标识码】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.04.042