瑞舒伐他汀对心肌肥厚大鼠心肌组织 Beclin-1蛋白表达的影响

丁同斌，简立国，张丽华，刘士超，赵江涛，程　栋

郑州大学第二附属医院心内科 郑州 450014

△男，1982年2月生，硕士，主治医师，研究方向：冠心病的基础与临床，E-mail:dingtongbin_2005@126.com



瑞舒伐他汀对心肌肥厚大鼠心肌组织 Beclin-1蛋白表达的影响

丁同斌△，简立国，张丽华，刘士超，赵江涛，程栋

郑州大学第二附属医院心内科 郑州 450014

△男，1982年2月生，硕士，主治医师，研究方向：冠心病的基础与临床，E-mail:dingtongbin_2005@126.com

关键词瑞舒伐他汀；压力超负荷；心肌肥厚；Beclin-1；大鼠；自噬

摘要目的：探讨瑞舒伐他汀对心肌肥厚大鼠心肌组织中自噬相关蛋白Beclin-1表达的影响。方法：健康雄性SD大鼠75只，随机分为假手术组、模型组和RSV组，每组25只，模型组和RSV组通过腹主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型，术后分别给予生理盐水和瑞舒伐他汀(4 mg/kg)灌胃,1次/d，连用4周。4周后测定心脏指数，用RT-PCR和Western blot法分别检测大鼠左心室心肌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠心肌明显肥厚，心脏指数升高，心肌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)；与模型组比较，RSV组大鼠心肌无明显肥厚，心脏指数降低，心肌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白表达下降(P<0.05)。结论：瑞舒伐他汀可抑制压力超负荷性心肌肥厚，其作用机制可能与降低自噬水平有关。

Effect of rosuvastatin on expression of Beclin-1 in myocardial tissue of rats with myocardial hypertrophy

DINGTongbin,JIANLiguo,ZHANGLihua,LIUShichao,ZHAOJiangtao,CHENGDong

DepartmentofCardiovascular，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

Key wordsrosuvastatin；pressure overload；myocardial hypertrophy；Beclin-1;rat;autophagy

AbstractAim: To investigate the effect of rosuvastatin(RSV) treatment on Beclin-1 expression in myocardial tissue of rats with myocardial hypertrophy due to autophagy.Methods: A total of 75 healthy male SD rats were randomly allocated into 3 groups:sham operation group, model group, and RSV group, 25 rats in each group. Model group and RSV group were given normal saline and RSV (4 mg/kg) by gavage,respectively, one time a day and for 4 weeks. The heart samples were collected after four weeks to detect the expressions of Beclin-1 mRNA and protein using RT-PCR and Western blot.Results: Compared with sham operation group, myocardial hypertrophy, cardiac index and the expressions of Beclin-1 mRNA and protein in the model group increased(P<0.05). Compared with the model group, there was no obvious cardiac hypertrophy,and cardiac index,the expressions of Beclin-1 mRNA and protein were lower in RSV group(P<0.05).Conclusion: RSV could inhibit pressure overload cardiac hypertrophy, and the mechanism may be related with the decreased expression of Beclin-1.

心肌肥厚是心力衰竭的主要原因之一。早期压力超负荷可引起代偿性心肌肥厚，有利于维持心脏输出量，但是长时间过度心肌肥厚会导致猝死[1]。羟甲基戊二酸甲酰辅酶A还原酶抑制剂(他汀类)的调血脂作用已得到公认。近年研究[2-4]表明，除降脂作用外，他汀类药物还具有抗炎、抗氧化、改善内皮细胞功能、抑制平滑肌细胞增殖等作用，并可有效抑制心肌肥厚及肥厚心脏向心衰的转变。自噬是一个高度保守的生命过程，生理条件下自噬是细胞长存蛋白和细胞器代谢再循环的主要方式，而过度自噬将导致自我消化而加重损伤。自噬相关蛋白Beclin-1在自噬和肿瘤中扮演重要角色，是一种双等位抑癌基因，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，在心肌缺血再灌注[5]和心肌肥大过程中发挥重要作用[6]。目前瑞舒伐他汀(rosuvastatin)的抗心肌肥厚分子机制尚不明确，该研究建立腹主动脉缩窄术致心肌肥厚大鼠模型，观察瑞舒伐他汀对模型大鼠术后Beclin-1表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂与设备健康雄性SD大鼠75只，体重(250±23) g，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(沪)2010-0005。瑞舒伐他汀(阿斯利康公司)，RNA提取试剂盒(上海莱枫试剂公司)，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，Beclin-1和β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)，Beclin-1兔抗大鼠单克隆抗体(美国Abcam公司)，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体(南通碧云天公司)，实时荧光PCR仪(美国Thermal Cycler Dice®Real Time System)，蛋白电泳转印定量系统(美国 V3 Western Workflow)。

1.2实验分组采用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、模型组和瑞舒伐他汀治疗组(RSV组)，每组25只。模型组和RSV组按下述方法造模：大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后固定、备皮、碘伏消毒，取腹正中切口，沿腹白线进入腹腔，游离暴露腹主动脉并沿长轴平行放置一个7号针头， 医用4号线结扎，立即抽出针头，造成腹主动脉狭窄，分层关闭腹腔。假手术组仅做腹主动脉分离，不结扎。3组术后均连续3 d腹腔注射青霉素20万U预防感染。术后假手术组、模型组灌胃生理盐水，RSV组灌胃瑞舒伐他汀4 mg/kg，1次/d，连续4周。

1.3观测指标

1.3.1形态学观察4周后用水合氯醛麻醉动物，称体重并处死，开胸取心脏称重，计算心脏指数，心脏指数=心脏质量(g)/体重(kg)。取左心室心肌组织，切片，苏木精染色15 min，中性树胶1～2滴封片。

1.3.2左心室心肌组织中Beclin-1 mRNA的检测

冰上操作取左心室心肌组织，按试剂盒说明书操作，进行RNA提取、反转录及PCR。Beclin-1上游引物：5’-AAGATTGAAGACACTGGAGGCA-3’，下游引物:5’-GAGGACACCCAAGCAAGACC-3’；内参β-actin上游引物：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’ ，下游引物： 5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’。产物经琼脂凝胶电泳，取标准品和β-actin 5 μL，加入EASY Dilution 45 μL并稀释cDNA。后离心，每个浓度设2个复孔标准品。每个待测样品设3个复孔。 温度95 ℃/1 min，60 ℃/1 min，72 ℃/1 min。反复40 次,最后一次延长 7 min。 TaKaRa Code TP800处理收集荧光信号。

1.4统计学处理采用 SPSS 17.0进行统计学分析，3组心脏指数、心肌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1大鼠心肌形态学变化3组心脏大体标本见图1，假手术组、模型组、RSV组心脏指数分别为(3.87±0.11)、(4.68±0.81)和(3.91±1.15) g/kg，3组比较，差异有统计学意义(F=7.853,P<0.001)；RSV组低于模型组，与假手术组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。HE染色结果见图2；显微镜下可见，假手术组心肌组织排列整齐，心肌细胞排列正常，间质无明显增生，无血管扩张和血管壁增厚等表现；模型组心肌组织排列紊乱，心肌细胞明显肥大，胞质丰富，细胞间隙不明显，细胞核增大； RSV组与假手术组无明显差异。

A：假手术组;B:模型组;C:RSV组。图1　3组心脏大体标本

A:假手术组;B:模型组;C: RSV组。图2　3组心肌组织形态学表现(HE,×400)

2.2心肌组织中Beclin-1的表达情况见表1。模型组心肌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白的表达水平均明显高于假手术组，而RSV组Beclin-1蛋白的表达水平较模型组降低。

表1　3组大鼠心肌组织中Beclin-1表达的比较

*:与假手术组比较，P<0.05;#:与模型组比较，P<0.05。

3讨论

正常机体在外界机械性刺激以及神经体液因子的刺激下，产生代偿性心肌肥厚，代偿性心肌肥厚能够增加心排出量，但长时间过度心肌肥厚会导致心脏功能失代偿，最终导致心衰和死亡。瑞舒伐他汀是一种高效的他汀类药物，具有良好的临床应用前景。近年研究[2-3]表明，他汀类药物具有多效性，不仅可抗炎、调脂、稳定斑块、调节免疫、抗肿瘤，而且具有改善心肌肥厚的作用。该研究选择瑞舒伐他汀进行实验，结果再次证实瑞舒伐他汀灌胃可明显抑制压力超负荷性引起的大鼠心肌肥厚。

自噬是细胞的代谢机制，被认为与神经退变、肿瘤发生、糖尿病等多种疾病密切相关。在心脏，自噬也是新陈代谢和应急供能的主要细胞机制，自噬体系缺乏或突变，往往导致各种心肌病和心肌肥大[7]。研究[6]表明，相比较于假手术组，腹主动脉缩窄模型大鼠心肌组织中Beclin-1表达显著增加，并且过表达Beclin-1基因能增加心肌肥厚的发生，证实在心肌肥厚的发生发展过程中Beclin-1基因具有关键作用。该研究结果表明，与心肌肥厚模型组比较，RSV组大鼠心脏无明显肥厚，心肌组织中Beclin-1蛋白的表达水平显著降低，说明瑞舒伐他汀可减少压力超负荷性心肌肥厚的发生，并且其机制可能与抑制自噬蛋白Beclin-1的表达有关。

综上所述，此次实验结果表明，瑞舒伐他汀可减少大鼠心肌肥厚的发生，并显著下调腹主动脉缩窄模型大鼠心肌组织中Beclin-1蛋白的表达。由此推测，瑞舒伐他汀对腹主动脉缩窄模型大鼠心肌肥厚的抑制机制可能与其能够抑制自噬的发生有关，但其确切的治疗机制尚不清楚，仍需进一步研究。

参考文献

[1]FREY N,KATUS HA,OLSON EN,et al.Hypertrophy of the heart：a new therapeutic target?[J].Circulation,2004,109(13):1580

[2]LOCH D,LEVICK S,HOEY A,et al.Rosuvastatin attenuates hypertension-induced cardiovascular remodeling without affecting blood pressure in DOCA-salt hypertensive rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2006,47(3):396

[3]HORSFALL LJ,NAZARETH I,PETERSEN I.Cardiovascular events as a function of serum bilirubin levels in a large, statin-treated cohort[J].Circulation,2012,126(22):2556

[4]KUWANO T,MIURA S,SHIRAI K,et al.Serum levels of bilirubin as an independent predictor of coronary in-stent restenosis:a new look at an old molecule[J].J Atheroscler Thromb,2011,18(7):574

[5]晏浩,徐建军,李文林,等.MicroRNA-30a调控Beclin-1对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护效应[J].中国病理生理杂志,2012,28(4):583

[6]PAN W,ZHONG Y,CHENG CF,et al.MiR-30-regulated autophagy mediates angiotensin Ⅱ-induced myocardial hypertrophy[J].PLoS One,2013,8(1):539

[7]SHENDE P,PLAISANCE I,MORANDI CA,et al.Cardiac raptor ablation impairs adaptive hypertrophy, alters metabolic gene expression, and causes heart failure in mice[J].Circulation,2011,123(10):U173

中图分类号R542.2

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.028