食品中甲醛残留量高通量检测方法研究

潘红艳，郭启雷，史海良，杨红梅（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）



食品中甲醛残留量高通量检测方法研究

潘红艳，郭启雷，史海良，杨红梅
（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

摘要：建立食品中甲醛残留量的高通量快速检测方法。样品中的甲醛在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼发生加成反应，经高效液相色谱紫外检测器检测，流动相乙腈∶水（6∶4，体积比），流速1.0 mL/min，检测波长355 nm。该方法在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好（R2＝0.999 9），检出限为0.5 mg/kg，加标回收率为80.2 %～107.7 %。该方法操作简便、快速、实用性广，可为面粉、粉条、虾皮、竹笋、腐竹、鱼类（鱿鱼、鲫鱼等）、血豆腐等多种食品基质中甲醛残留量的检测提供参考。

关键词：甲醛；高效液相色谱；食品

甲醛是一种原生质毒素，可严重危害人体细胞、中枢神经系统、皮肤和粘膜，甲醛慢性中毒可导致器官癌变，急性中毒会导致腹泻、腹痛、呕吐和头晕等症状[1]。食品中甲醛的来源比较复杂，一是人为添加，不法商贩常将甲醛添加到食品中，用于防腐、保鲜、漂白等作用，如食品加工中的“吊白块”，水产品保鲜中的“福尔马林”；二是食品本身含有，如某些香菇产品中含有大量甲醛[2]，冻鳕鱼等水产品自身代谢产生少量甲醛[3]；三是生产加工过程中受到包装容器等的污染；四是食品配料中含有的甲醛。

由于食品化学成分较复杂，影响因素较多，因此甲醛残留量的测定受到食品基体成份的干扰较大[4]。目前甲醛的测定方法有分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等[5-8]。李光等[4]用吊白块在酸性条件下分解出甲醛和二氧化硫等化合物，将蒸馏液用蒸馏水吸收，用显色剂变色酸或乙酰丙酮与蒸馏液中的甲醛反应，对某些食品同时测定蒸馏液中的二氧化硫和甲醛。此方法耗费时间较长，不利于大量样品的处理。隋雪燕等[9]采用2，4-二硝基苯肼衍生，环己烷提取，用电子捕获检测器气相色谱法测定，建立了测定纺织品中游离甲醛的衍生气相色谱法，此方法适用范围较窄，在实际市场监督中往往涉及多种基质。陈笑梅等[10]研究了直接用于液相色谱测定甲醛与2，4 -二硝基苯肼的反应条件，使反应在弱酸性和50 %的乙腈条件下进行，反应产物甲醛衍生物不需要有机溶剂萃取，可直接用于液相色谱分析，避免了萃取过程的损失。

虽然目前在甲醛残留量检测方面的研究较多，现行检测甲醛的标准有地方标准、国家标准、出入境标准等[11-15]，参考标准种类繁多。文章对现行参考标准中检测方法进行比较和优化，建立了一个适用性广，简便快速的高通量甲醛检测方法。

1　材料与方法

乙腈、正己烷（色谱纯），乙酸钠，冰乙酸，氯化钠，磷酸氢二钠，37 %盐酸，2，4-二硝基苯肼：纯度≥95 %北京市兴津化工厂。

Agilent1200高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）：安捷伦公司；恒温水浴振荡器：上海申能博彩生物科技有限公司；Milli-Q纯水系统：美国Millipore公司；电子天平感量（0.000 1 g、0.01 g）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HY-5回旋振荡器：国华电器有限公司；微孔滤膜0.22 μm，有机相津腾。

1.1试剂配制

衍生液1：称取25 mg 2，4-二硝基苯肼溶于6 mL 37 %盐酸，加水定容至25 mL。

衍生液2：（乙酸钠缓冲溶液，pH＝5）为称取3.64 g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。2，4-二硝基苯肼溶液（0.6 g/L）为称取2，4-二硝基苯肼300 mg，用乙腈溶解定容至500 mL。量取100 mL乙酸钠缓冲溶液和100 mL 2，4-二硝基苯肼溶液混匀，配制成衍生液2。

衍生液3：称取50 mg 2，4-二硝基苯肼，乙腈定容至25 mL。

盐酸-氯化钠溶液：称取2g氯化钠于100mL容量瓶中，用少量水溶解，加6mL37%盐酸，加水定容至刻度。

磷酸氢二钠溶液：称取18 g Na2HPO4·12 H2O，加水定容至100 mL。

甲醛标准储备液：取1 mL 36 %～38 %甲醛溶液，用水定容至500 mL，使用前按GB/T 2912.1-1998中的亚硫酸钠法标定甲醛浓度。此溶液于棕色瓶中4℃冰箱中保存，一个月内稳定。准确量取一定量经标定的甲醛标准储备液，配制成50 μg/mL的甲醛标准应用液，此溶液现用现配。

1.2样品处理

试样选取可食用部分经粉碎机充分粉碎并混合均匀，面粉、粉丝、腐竹等试样在0℃～4℃冷藏，虾皮、竹笋、鱼类、血豆腐等在-18℃以下保存。

称取均匀粉碎的试样2.0 g（准确至0.01 g），置于50 mL三角瓶中，准确加入20.0 mL衍生液2。盖上塞子，涡旋混匀后置于60℃恒温振荡器中150 r/min振摇1 h，取出冷却至室温。取上层清液过0.22 μm滤膜上机测定。

若试样中脂肪含量较高，取上述提取液10 mL于50 mL塑料离心管中，加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液，涡旋混合，离心后弃去上清液，取下层溶液过0.22μm滤膜上机测定。

1.3甲醛衍生物标准溶液的制备

移取0、10、20、100、200、400 μL甲醛应用液（50 μg/mL），置于10 mL具塞刻度管中，用衍生液2定容至10 mL，盖上塞子后摇匀，60℃水浴加热1 h，取出冷却至室温。过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。

1.4仪器条件

色谱柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：乙腈∶水为（60∶40，体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：355 nm；进样量：20 μL

2　结果与讨论

2.1方法对比

2.1.1衍生液比较

比较3种检验标准中不同衍生条件对测定结果的影响。涉及的检验标准为：SC/T 3025-2006《水产品中甲醛的测定》；SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛的测定液相色谱法》；GB/T 21126-2007《小麦粉与大米粉及其制品中甲醛次硫酸氢钠含量的测定》。

取一定量甲醛应用液于10 mL具塞刻度管中，分别按3种检验标准的衍生方法在同一温度下衍生相同时间。

2.1.1.1 SC/T 3025-2006《水产品中甲醛的测定》

取0.5 mL甲醛应用液于10 mL具塞刻度管中，加入0.2 mL衍生液1，加水定容至10 mL，涡旋混匀后60℃水浴30 min。取出冷却至室温，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。

2.1.1.2 SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛的测定液相色谱法》

取0.5 mL甲醛应用液于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，涡旋混匀后60℃水浴30 min。取出冷却至室温，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。2.1.1.3 GB/T 21126-2007《小麦粉与大米粉及其制品中甲醛次硫酸氢钠含量的测定》

取0.5 mL甲醛应用液于10 mL具塞刻度管中，加入2 mL盐酸氯化钠，1 mL磷酸氢二钠，0.5 mL衍生液3，加水定容至10mL。涡旋混匀后60℃水浴30 min。取出冷却至室温，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。

比较不同衍生液在同一衍生条件下产生的甲醛衍生物的峰面积，比较结果见图1。

图1不同衍生液比较Fig.1 Different derived liquid comparison

图2衍生温度比较Fig.2 Derived temperature comparison

由图1可见，2号衍生液和3号衍生液的衍生效果相当，其中以2号效果最佳，乙腈和2，4-二硝基苯肼的含量均对衍生效果产生一定影响，陈笑梅[10]等的研究也说明乙腈含量在20 %～70 %之间对衍生反应有较好的作用。当样品中含有较高的甲醛时，也需要有充分的2，4-二硝基苯肼与其发生反应，因此选取SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛的测定液相色谱法》中的衍生液进行进一步衍生条件的优化。

2.1.2衍生温度选择

取甲醛应用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，涡旋混匀后分别置于恒温水浴锅中衍生30 min，取出冷却至室温，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。根据3个不同标准给出的不同衍生温度，选取40、50、60、70℃4个温度进行比较，分析其对甲醛衍生物的峰面积的影响，比较结果见图2。

由图2可见，在温度为60℃时，甲醛衍生物的峰面积最高，温度有助于衍生反应的进行，而温度过高可能会导致衍生物的不稳定。因此实验选取60℃为最佳衍生温度。

2.1.3衍生时间选择

取甲醛应用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，涡旋混匀后60℃水浴，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC测定。同时选取四种基质（腐竹、血豆腐、虾皮、面粉）加入适量甲醛应用液，分析基质干扰对衍生时间的影响。根据3种不同标准给出的衍生时间，分别测定衍生10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min后所生成衍生物的峰面积。比较结果见图3。

图3衍生时间比较Fig.3 Derived time comparison

由图3可见，甲醛应用液在水浴30 min时刻达到最高峰面积，随着衍生时间的继续增加，峰面积有所降低并趋于稳定。腐竹、血豆腐、虾皮、面粉的最佳衍生时间分别是60、60、70、70 min，虾皮在60 min之后的衍生效果并没有显著性变化，由此看出不同样品基质的存在会对衍生过程起到一定程度的影响，综合各种不同基质，试验最终选取60℃水浴60 min为合理衍生时间。

2.1.4色谱条件优化

经二极管阵列检测器的波长扫描，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的吸收图谱见图4，根据此图谱试验最终选取检测波长为355 nm。

图4甲醛衍生物吸收图谱Fig.4 Absorption spectrum of formaldehyde derivatives

对比了乙腈与水的体积比比例在70∶30、60∶40、 50∶50分别在0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速下甲醛衍生物的色谱峰，实验结果表明乙腈与水的体积比在60∶40，流速为1.0 mL/min时，色谱峰的保留时间和分离效果最好，并不受基质中的杂峰干扰，色谱如图5所示。

图5甲醛标准溶液衍生物色谱图Fig.5 Chromatogram of formaldehyde derivative

2.2线性关系和检出限

在本方法最终确定的条件下对甲醛标准溶液进行测定，甲醛浓度在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系，线性方程为y＝745.27x - 1.262，相关系数R2＝0.999 9。样品检出限为0.5 mg/kg。

由于空气、试剂等中均有微量甲醛残留，因此在试验中需进行空白试验，除不加试样外，其他过程均按1.3步骤进行处理。结果计算时需扣除空白。

2.3方法回收率和精密度

对面粉、粉条、虾皮、竹笋、腐竹、鲫鱼、血豆腐样品进行基质加标试验，按试验最终选定的方法步骤进行，平行测定5次，结果见表1。

表1方法回收率和精密度（n=5）Table 1 The recovery and precision of the method

由表1可知，分别在样品中加入0.5、1.0、5.0 mg/kg的甲醛标准溶液，得到的回收率在80.21 %～107.66 %之间，方法回收率较好，可实现对食品中甲醛残留量的快速检测。

3　结论

建立了食品中甲醛残留量的快速测定方法，实现在同一时间对多个样品的批量处理。在酸性条件下，样品中残留的甲醛与2，4-二硝基苯肼发生加成反应，生成黄色的2，4-二硝基苯腙，提取液在355 nm波长下，经液相色谱法（HPLC）测定，外标法定量。此方法适用于面粉、粉条、虾皮、竹笋、腐竹、鱼类（鱿鱼、鲫鱼等）、血豆腐等多种食品基质中甲醛残留量的鉴别及检测。方法快速简便，灵敏度高，重现性好。可满足对多种食品中甲醛含量的准确测定。

参考文献：

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[13]中华人民共和国农业部. SC/T 3025-2006水产品中甲醛的测定[S].北京:中国农业出版社,2006:1-6

[14]中华人民共和国国家质量监督检验总局. SN/T 1547-2011进出口食品中甲醛的测定液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2011: 1-5

[15]中华人民共和国国家质量监督检验总局. GB/T 2912-2009纺织品甲醛的测定[S].北京:中国标准出版社,2009:1-11

The Study of High-throughput Detection Method for Formaldehyde Residues in Food

PAN Hong-yan，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，YANG Hong-mei
（National Food Quality & Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Abstract：A rapid detection method was developed. The samples were addition with 2，4 -dinitrophenylhydrazine under acidic conditions，detected by HPLC UV detector. The mobile phase was acetonitrile∶water（6∶4，mL/mL），at a pump flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength of 355 nm. Under the optimal conditions，the linear range of formaldehyde was 0.05 μg/kg-5.0 μg/kg with correlation coefficient higher than 0.999 9，the limit of quantification was 0.5 mg/kg，the mean recoveries were 80.2 %-107.7 %. This method was simple，rapid and suitable for most food matrices such as flour，vermicelli，shrimp，bamboo shoots，yuba，fish（Carp，Squid etc），blood tofu etc.

Key words：formaldehyde；HPLC；food

收稿日期：2014-09-09

作者简介：潘红艳（1986—），女（汉），助理工程师，硕士研究生，研究方向：食品安全。

基金项目：公益性行业科研专项项目（2012104003-2）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.037