粗子草总黄酮的提取工艺研究

曾谛，王玉涛，黄琴，龙为，朱思明，*（.华南理工大学轻化工研究所，广东广州50640；2.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什844006；3.喀什大学新疆自治区教育厅叶尔羌绿洲生态与生物资源研究实验室，新疆喀什844006）



粗子草总黄酮的提取工艺研究

曾谛1，3，王玉涛2，3，黄琴1，龙为1，朱思明1，*
（1.华南理工大学轻化工研究所，广东广州510640；2.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什844006；3.喀什大学新疆自治区教育厅叶尔羌绿洲生态与生物资源研究实验室，新疆喀什844006）

摘要：粗子草是一种稀有的伞形科药用植物，当地人泡茶饮用可用做抗炎及降血压用。以乙醇为提取剂，设计单因素实验和正交试验，考察了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对粗子草中总黄酮得率的影响。结果表明：粗子草富含黄酮；各因素对粗子草总黄酮提取的影响顺序是：提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间；粗子草总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度60 %，料液比1∶30（g/mL），提取时间90min，提取温度60℃。研究可为药用植物粗子草的保护性开发提供参考。

关键词：粗子草；总黄酮；提取

黄酮类化合物是植物的次级代谢产物，广泛的存在于植物的果实和种子中[1]。据报道，黄酮有清除体内自由基、消炎、降低高血压等作用。粗子草，被子植物门（Angiospermae）、双子叶植物纲（Dicotyledoneae）、原始花被亚纲（Archichlamydeae）、伞形目（Umbelliflorae）、伞形科（Umbelliferae）、瘤果芹属（Trachydium）[2]。粗子草生于高山草甸中，或林下，属多年生草本。瘤果芹属药用植物，国内外均未对其展开系统的研究和开发。在中国高海拔地区，当地群众一直将其作为药物泡茶饮用，尤其是世代生存在帕米尔高原（平均海拔4 000 m）的塔吉克族群众，以泡茶饮用来消炎和降血压用，国内目前对粗子草的研究鲜有报道。

近年来，国内外学者对从植物中提取总黄酮进行了大量的研究。黄酮的提取与分离，在医药食品等领域有着巨大的经济效应[3]。本文以粗子草为原料，采用传统的乙醇浸提法，先进行单因素试验，再进行正交试验，确定其乙醇提取的最佳工艺。为粗子草的进一步研究提供参考。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

粗子草：采自新疆帕米尔高原，海拔5 000 m以上；芦丁：上海晶纯生化科技股份有限公司；无水乙醇（AR）：天津致远化学试剂有限公司；亚硝酸钠（AR）：广州化学试剂厂；亚硝酸铝、氢氧化钠（AR）：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HHS-2S型恒温水浴锅：上海宜昌仪器纱筛厂；TU-1901型双束光紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1粗子草提取物的定性反应

1.3.1.1盐酸锌粉反应[4]

移液管移取粗子草提取物置于锥形瓶中，加入少量Zn粉，滴加浓盐酸4滴～5滴，震荡后，观察溶液变化。

1.3.1.2铝盐反应[5]

向粗子草提取液中加入质量分数为1 %Al（NO3）3溶液，观察溶液的颜色变化。

1.3.1.3氨显色反应[5]

将粗子草乙醇提取液滴于滤纸上风干，以挥发氨熏滤纸，观察其颜色变化，再将滤纸在通风处放置久后，再观察其颜色变化。

1.3.2芦丁标准曲线绘制[6-8]

黄酮类化合物在亚硝酸钠做稳定剂情况下，与硝酸铝在碱性条件下作用生成黄色络合物，呈黄色，可用紫外分光光度计测量黄酮类化合物的含量。精密称取120℃减压干燥至恒重，加入75 %乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中。分别取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于锥形瓶中，先加5%NaNO21mL，再加10%Al（NO3）31 mL，摇匀后放置6 min，再加入4 % NaOH 15 mL，摇匀后静置20 min，加75 %乙醇定容至100 mL。

用第一个样品做空白样，在450 nm～800 nm范围内扫描其他样品，如图1所示，得扫描曲线，确定总黄酮的测量波长为510 nm。

在510 nm处，分别测出6个标准溶液的吸光度，并对吸光度与黄酮质量浓度的关系作图，如图2示。通过线性回归，得到质量浓度与吸光度的关系：

C＝0.089 6A + 0.000 3，R2＝0.999 4

式中：A为吸光度；C为芦丁的质量浓度，mg/mL。

图1芦丁吸收峰扫描Fig.1 Rutin absorption wavelength scan

图2芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

1.3.3粗子草总黄酮的提取及测定[9-10]

将粗子草用研钵研磨，过40目筛，准确称取一定量的研磨后的粗子草，用一定量的乙醇溶液在一定条件下浸提取一定时间，过滤，得黄色滤液，在100 mL容量瓶中定容。取2 mL滤液，按绘制标准曲线的方法显色，在510 nm处，用紫外-可见分光光度计测定其吸光度，质量浓度由下式计算而得，C＝0.089 6A + 0.000 3

粗子草总黄酮得率的计算公式为：Y/（mg/g）＝（C× 50/2×100）/m

式中：Y为粗子草的得率，以1 g粗子草提取的总黄酮mg表示；C为粗子草总黄酮的质量浓度，mg/mL；m为所用粗子草的质量数，g。

2　结果与分析

2.1粗子草黄酮类物质的定性分析

2.1.1盐酸锌粉反应

经过盐酸锌反应后，溶液变成紫红色。说明溶液中含有黄酮类化合物。因为黄酮类的乙醇溶液在盐酸存在的情况下，能被锌粉还原，生成花色苷元从而呈现红色或紫色反应（个别为淡黄色、橙色、紫色或蓝色）。

2.1.2铝盐反应

跟铝盐在溶液中反应后，溶液成黄褐色，说明有黄酮类物质存在。因为黄酮类化合物结构中，凡具有C3-羟基、C4-羟基、C5-羟基、C4-羰基或邻二酚羟基时，可以与许多金属盐类试剂如铝盐、镁盐等反应，生成有色的络合物，有的还产生荧光，因此可用于鉴别黄酮类化合物。

2.1.3氨显色反应

以挥发氨熏滤纸后，溶液立刻产生了深黄的颜色，当滤纸放置久后，黄色消失。这是黄酮类化合物的典型反应。在碱性条件下，二氢黄酮会转化为查尔酮，呈黄绿色。

2.2粗子草总黄酮提取的单因素试验

2.2.1溶液体积分数的影响

准确称取0.500 g研磨后的粗子草，按1∶30（g/mL）的比例本别加入无水乙醇40 %、50 %、60 %、70 %、80 %乙醇溶液，在温度为60℃浸提120 min，测定并计算不同乙醇体积分数下粗子草的得率，得到乙醇体积分数与总黄酮得率关系如图3。

图3溶剂的体积分数对粗子草总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoid

如图3所示，粗子草总黄酮得率先随乙醇浓度的增大先增大后减小。当乙醇浓度在60 %时，其得率最高；乙醇浓度大于60 %后，总黄酮得率随乙醇浓度的增大而逐渐降低。这可能是因为乙醇浓度过低时，总黄酮提取不完全；而乙醇浓度过高，导致脂溶性物质溶出较多，影响总黄酮的溶出，因此确定60 %乙醇浓度为最佳条件。

2.2.2料液比的影响

准确称取0.500 g过40目的粗子草粉，按料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取温度为60℃，提取时间为120 min，测定并计算相应条件下粗子草总黄酮的得率，得到料液比与粗子草总黄酮得率的关系如图4所示。

从图4中可以得出，在其它因素不变的情况下，粗子草总黄酮的得率随所用溶剂用量的增加而增大，一般说来，在其他条件一定的情况下，物质的溶解度一定，则总黄酮溶出量随着提取溶剂的量增加而增加，但是，当溶剂量达到一定数值时，溶质全部溶出，所以料液比继续增加对得率的提升不明显。确定1∶30（g/mL）为最佳提取料液比。

图4料液比对粗子草总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoid

2.2.3提取时间的影响

准确称取0.500 g过40目的粗子草，按料液比1∶30（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取温度为70℃，提取时间为30、60、90、120、150 min，测定并计算相应条件下粗子草总黄酮的得率。提取时间与粗子草总黄酮得率的关系如图5所示。

图5提取时间对粗子草总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由图5可知，粗子草总黄酮的得率随着时间的增大而增大，但是当时间达到90 min时，得率随着时间的增加变化不明显，说明总黄酮基本提取完毕，为了节省时间和降低能耗，确定90 min为最佳提取时间。

2.2.4提取温度的影响

准确称量0.500 g过40目研磨后的粗子草，按1∶30（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取温度为40、50、60、70、80℃，提取时间为90 min，测定并计算相应条件下粗子草总黄酮的得率。提取温度与粗子草总黄酮得率关系如图6所示。

由图6可知，在其它条件不变的情况下，粗子草总黄酮的得率随提取温度的提高先增大后减小。提取温度在60℃左右时，得率最高。之后随着温度的提高，得率反而下降。这可能是因温度的提高，部分黄酮类化合物被氧化，同时，温度升高，其他非黄酮类物质的溶出增加，同样会导致总黄酮得率降低。

图6提取温度对粗子草总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoid

2.3粗子草总黄酮提取工艺的优化

单因素试验表明，溶剂体积分数、料液比、提取时间、提取温度对粗子草总黄酮得率均有影响。因此，在单因素试验的基础上，通过L9（34）正交试验，进一步研究它们的影响。

表1正交试验设计及结果Table 1 Factor and level of orthogonal experiment and the result

由正交试验的结果可知，乙醇浓度、料液比、提取时间以及温度对粗子草总黄酮的得率均有显著的影响，其中浓度，料液比，温度影响及其显著。影响的顺序为：提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间。同时，根据正交试验结果可知，粗子草总黄酮最佳提取条件为：乙醇浓度为60 %，料液比为1∶30（g/mL），提取时间为90 min，提取温度为60℃。验证此时总黄酮的得率为96.028 mg/g，高于正交试验各组组合的结果。

表2方差分析表Table 2 Analysis of variance table

3　结论

1）通过颜色试验发现，粗子草中存在黄酮类化合物。

2）乙醇浓度、料液比、提取时间以及温度对粗子草总黄酮的得率均有影响，影响的顺序为：提取温度＞乙醇浓度＞料液比＞提取时间；根据正交试验结果可知，粗子草总黄酮最佳提取条件为：乙醇浓度为60 %，料液比为1∶30（g/mL），提取时间为90 min，提取温度为60℃，此时总黄酮的得率为96.028 mg/g。

3）粗子草作为稀有的伞形科植物，可进一步研究其挥发油和总多酚等功效成分。

参考文献：

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Study on the Extraction of Total Flavones from T.roylei

ZENG Di1，3，WANG Yu-Tao2，3，HUANG Qin1，LONG Wei1，ZHU Si-Ming1，*
（1. College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2. Department of Biologic and Geographic Sciences，Kashgar University，Kashgar 844006，Xinjiang，China；3. Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis，Kashgar University，Kashgar 844006，Xinjiang，China）

Abstract：T.roylei is a rare medicinal umbelliferous plant，as tea drinking that can cope with altitude sickness and hypertension. The total flavones were extracted with alcohol as the solvent from T.roylei and the extract was analyzed qualitatively by means of color development reaction. The effects of the extraction conditions such as the concentration of ethanol，the ratio of T.roylei to solution of ethanol，the extraction time and extraction temperature were studied. The results showed that T.roylei was rich in flavonoids；the rate of T.roylei 's flavones effects in the order of extraction temperature，ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time. The best extraction of T.roylei 's flavones was that The concentration of ethanol was 60 %，the ratio of T.roylei to solution of ethanol was 1∶30（g/mL），the extraction time was 90 min and the extraction temperature was 60℃. Research can provide a reference for medicinal T.roylei's protective development.

Key words：T.roylei；flavonoid；extraction

收稿日期：2015-06-21

*通信作者：朱思明（1976—），男（汉），教授，博士，研究方向：糖厂综合利用研究。

作者简介：曾谛（1991—），男（汉），硕士研究生在读，研究方向：天然产物的提取。

基金项目：国家自然科学基金项目（U1203183）；广东省科技计划项目（2013B020310006, 2014A020209019）；华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2014ZZ0050）；新疆维吾尔族自治区科技创新团队建设项目（201475002）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.014