一株产广谱高效抑菌活性细菌素植物乳杆菌的筛选与鉴定

胡美忠，张新卓，刘芸

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁510025）

一株产广谱高效抑菌活性细菌素植物乳杆菌的筛选与鉴定

胡美忠，张新卓，刘芸

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁510025）

为获得产广谱高效抑菌活性细菌素的乳酸菌，采用agar－spot－test法、琼脂扩散法结合生理生化和16SrDNA序列同源性分析法从贵州传统发酵食品中分离、筛选、鉴定乳酸菌并对其产生抗菌物质的生理生化特性进行鉴定。结果表明：从贵州传统发酵食品中分离出乳酸菌110余株并从中筛选出效果最好的菌株416，鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其产生的抑菌物质为多肽类，对蜡样芽孢杆菌和李斯特菌有较强的抑制作用，具有作为生物防腐剂应用于食品行业的潜力。

细菌素；抑菌活性；植物乳杆菌

食品防腐几千年来一直是挡在人们面前的一大难题。据估计，全世界每年有10%～20%的食品损失源于腐败变质，其经济损失巨大。为了预防或延缓食品腐败，人们往往在食品中添加一些防腐剂［1］。防腐剂可分为天然防腐剂和化学防腐剂。以山梨酸钾、苯甲酸钠为代表的化学防腐剂因价格低廉、防腐效果较好而广泛应用于食品加工。但有研究发现［2］，化学防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题，加之消费者对食物的安全、自然、新鲜、味美及营养不被加工过程破坏等要求越来越苛刻，因此，化学防腐剂在食品中的应用越来越受限制。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性和热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点，正逐步取代化学防腐剂。开发高效、安全、稳定的天然防腐剂已成为食品添加剂研究的热点。采用有益微生物发酵生产天然防腐剂成本低，生产周期短，并可通过现代生物技术手段对菌种进行改造、代谢调控、分子修饰等操作提高产品产量和质量。因此，有益微生物来源的天然防腐剂开发具有广阔的前景。

人类利用乳酸菌已有数千年的历史，乳酸菌及其发酵产物被公认为安全的物质，可直接应用于食品。乳酸菌的代谢过程产生乳酸、柠檬酸、草酸和酒石酸等有机酸，该有机酸可破坏细菌的细胞膜改变其通透性，进而具有杀死致病菌的作用［3］。同时，乳酸菌在代谢过程中可产生过氧化氢，而过氧化氢分解产生的活性氧具有极强的氧化能力［4］。耿彦生等［5］研究发现，乳酸对于过氧化氢的杀菌效果具有增强及稳定作用。部分乳酸菌在代谢过程中还可产生活性多肽——细菌素，大部分细菌素能抑制与其产生菌近缘菌株的生长繁殖，其中有极少部分细菌素具有广谱抗菌活性故具有应用于食品防腐、医药卫生等方面的潜力。近年来，分离自乳酸菌的细菌素因其杀菌功效好，来源安全，可靠性高等特性受到越来越多的瞩目［6］。如，产自乳酸链球菌的细菌素Nisin能抑制食品中腐败菌和致病菌等革兰氏阳性菌，现在已被广泛应用于罐头和乳制品的防腐；但Nisin对革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌及病毒等无抑制作用，故而具有一定的局限性［7－8］。因此，筛选具有高效广谱抑菌效果的乳酸菌抗菌肽作为一种天然防腐剂仍是国内外研究的热点［9－10］。目前，国内外专家就这方面工作做了大量研究。如，Meizhong H等［11］发现，植物乳杆菌素163具有广谱抑菌作用而具有应用于食品防腐的潜力；饶瑜等［12］筛选出用于四川泡菜生物保鲜的产细菌素乳酸菌。

贵州拥有丰富的具有各民族特色的发酵食品及特殊的生境，也具有筛选产高效广谱乳酸菌细菌素乳酸菌的优势。因此，从贵州传统发酵食品中极有可能筛选出应用前景好的乳酸菌菌株。为此，笔者采用agar－spot－test方法从贵州传统发酵食品分离筛选乳酸菌，以琼脂扩散法复筛抑菌效果最好的乳酸菌，采用生理生化和16SrDNA序列同源性分析法鉴定所选乳酸菌，并对其产生的抗菌物质抑菌活性进行检测，以期获得产广谱高效抑菌活性细菌素乳酸菌。

1材料与方法

1．1供试材料

1．1．1样品 贵州传统发酵食品（酸菜、酸肉、腌鱼等）采集于贵州省铜仁市、贵阳市、安顺市和遵义市。

1．1．2指示菌 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠杆菌（ATCC 25922）、李斯特菌（ATCC 19114）购自美国标准菌库；蜡样芽孢杆菌（AS 1．184）购自中国普通微生物菌种保藏中心，由南京农业大学食品科技学院酶工程室保藏提供。

1．1．3培养基1）MRS培养基。培养乳酸菌，培养温度37℃，静置培养。配方：蛋白胨10．0g，牛肉膏5．0g，酵母粉4．0g，葡萄糖20．0g，吐温－80 1mL，K2HPO4·3H2O 1．52g，CH3COONa 3．02g，柠檬酸三铵2．0g，MgSO4·7H2O 0．2g，MnSO4·H2O 0．03g，琼脂（固体）18．0g，蒸馏水1 000mL，pH 6．2，121℃，20min灭菌。2）LB培养基。培养细菌，培养温度37℃。配方：胰蛋白胨10g／L，NaCl 10g／L，酵母浸膏5g／L，蒸馏水1 000mL，pH 7．0，121℃，20min灭菌。

1．1．4试剂 革兰氏染色试剂盒（杭州百思生物技术有限公司），细菌基因组提取试剂盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA），Taqtm DNA聚合酶（TaKaRa），Gel Extraction Kit（TaKaRa），过氧化氢酶（Sigma）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、α－凝乳蛋白酶均由Sigma出产。

1．2乳酸菌的分离纯化

利用乳酸菌在代谢过程中产生有机酸能使碳酸钙溶解出现溶钙圈的原理，在MRS培养基中添加碳酸钙筛选产酸的菌落，再利用过氧化氢酶、革兰氏染色测试。即在无菌条件下用生理盐水将样品稀释成不同浓度，取10－3样品稀释液涂布于混有0．3%碳酸钙MRS固体培养基上。37℃培养48h后，选取具有明显溶钙圈的菌落划线于MRS固体培养基上继续纯化，纯化的菌落进行过氧化氢酶测试、革兰氏染色镜检。筛选出过氧化氢酶阴性、革兰氏染色阳性的菌落，初步认定为乳酸菌，取对数期的菌液，用含25%甘油作为保护剂的MRS肉汤培养基－70℃下保藏待用。

1．3产细菌素乳酸菌的初筛

利用agar－spot－test方法［13－14］筛选纯化的乳酸菌是否产生抗菌物质。方法：纯化的乳酸菌在无菌条件下点接种于MRS固体培养基上，37℃培养48h长出菌落后，向MRS平板倾倒混有指示菌金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的LB培养基（含1．5%琼脂），37℃继续培养24h后观察。乳酸菌菌落周围出现抑菌圈且抑菌圈直径大于10mm可初步判定产生抑菌物质。

1．4产细菌素乳酸菌的复筛

初筛的各菌株经MRS培养基活化后，种子液按1%（V／V）的比例接种于100mL MRS培养基，于37℃条件下静置培养24h，用8 000r／min的速度离心15min，除去菌体，利用琼脂扩散法定量测试各菌株的抑菌活性［15－16］，筛选出活性较强的菌株。将活性较强菌株的无细胞上清液分成2份，一份用3NNaOH调节pH至5．5，以用乳酸调节pH至5．5 的MRS培养基作为空白对照，采用琼脂扩散法测试其抑菌活性，借以排除酸抑菌活性的影响；另一份加入过氧化氢酶，以不加过氧化氢酶的无细胞上清液作为对照，琼脂扩散法测试其抑菌活性，借以排除过氧化氢抑菌活性的影响。

1．5目标菌株的生理生化及16SrDNA鉴定

选取从传统发酵食品筛选出的1株排除酸及过氧化氢影响后仍具有较好活性的菌株，首先对其进行生理生化鉴定，包括革兰氏染色、细胞形态、菌株生长能力，产酸产气、有无鞭毛以及对碳水化合物的发酵能力测试。然后对其进行16SrDNA鉴定。PCR引物：16SF：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，16SR：5’－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3’。PCR扩增程序：用DNA Engine Peltier Thermal Cycler（Bio－Rad，Mex－ico）进行DNA放大，95℃预变性4min；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；最后72℃聚合10min。PCR扩增产物用TakaRa Gel Extraction Kit（中国，南京）纯化，送Genscript Bio．公司（中国，南京）进行测序。得到的序列与DNA Databases进行同源性匹对。

1．6目标菌株产抑菌物质蛋白酶敏感性测试

精密配制胰蛋白酶（2．5KU／mg）、蛋白酶K （30U／mg）、α－凝乳蛋白酶（1KU／mg）和胃蛋白酶（3KU／mg）溶液5mg／mL，取0．2mL各酶溶液于离心管中，并加入已调节至各酶最适pH的目标菌株无细胞上清液0．8mL，以加0．2mL无菌水于0．8mL目标菌株无细胞上清液的溶液为对照，37℃水浴3h后调节pH至5，测试目标菌株的抑菌活性。

1．7目标菌株产抑菌物质对其他细菌的抑菌效果

目标菌株的无细胞上清发酵液排除有机酸和过氧化氢影响后，用琼脂扩散法测试其对李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌活性。

2结果与分析

2．1乳酸菌的分离纯化与筛选

2．1．1分离纯化 从贵州传统发酵食品中筛选出110株乳酸菌。说明，该试验方法简便高效，能迅速、大量地从发酵食品中纯化乳酸菌。此外，贵州传统发酵食品的制备主要通过乳酸菌发酵获得，乳酸菌发酵不仅使发酵食品具备特殊的风味，而且对于发酵食品的防腐具有特别的贡献。从发酵食品中分离乳酸菌，筛选出能产细菌素的乳酸菌是一个极好的样品来源。如，袁玮［17］曾在贵州省苗族腌酸汤中筛选出抑菌效果显著的植物乳杆菌L6。

2．1．2产细菌素乳酸菌的初筛 常用乳酸菌产抑菌物质的筛选方法：菌落活化→接种→培养后离心得上清液→抑菌试验。此方法工作量大，一批次测试的菌株数不多。对于大量菌株而言，工作量繁重。利用agar－spot－test方法则可迅速地定性筛选出能产抑菌物质的乳酸菌，同一批次可测试数十株乳酸菌，可节省试验时间。利用agar－spot－test从纯化的110株乳酸菌中筛选得到45株具有较强抑菌活性的菌株（图1）。

图1 Agar－spot test法初筛产广谱抗菌细菌素部分乳酸菌的抑菌效果Fig．1 The antibacterial effect of some screened bacteriocin L．plantarumstrains with efficient broad－spectrum bacteriostatic activity by Agar－spot test

2．1．3产细菌素乳酸菌的复筛 复筛就是排除酸及过氧化氢的影响，确定产生抗菌作用的是细菌素。该试验从110株菌株中筛选得到编号为416的菌株，其能产生对金黄普通球菌（ATCC25922）和大肠杆菌（ATCC25923）具有较强抑菌活性的物质。

2．2菌株416的生理生化及16SrDNA鉴定

从表可见，菌株416的过氧化氢酶反应呈阴性，发酵葡萄糖产酸、不产气，无运动性，不产硫化氢；同时，该菌株能发酵纤维二糖、七叶灵、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸盐、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、水杨苷、蔗糖、海藻糖和木糖。将菌株416的16SrDNA基因序列与www．ncbi．nlm．nlh．gov网站GENBANK＋EMBL＋DDBJ＋PDB基因库BLAST序列进行比对发现，与4株植物乳杆菌的相似性均达100%。因此，综合形态学、生理生化特性，通过对照《伯杰氏细菌鉴定守则》及《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》的鉴定项目及16SrDNA同源性比较结果，可以把菌株416归为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

表 菌株416的生理生化特性Table Physiological and biochemical characteristics of 416strain

2．3目标菌株416产抑菌物质的蛋白酶敏感性测试

从图2可见，菌株416产的抑菌物质对蛋白酶敏感。其中，Typsin的抑菌圈直径为（12．76± 0．59）mm，Protease K的抑菌圈直径为（13．01± 0．21）mm，α－Chymotrypin的抑菌圈直径为（12．89±0．23）mm，Pepsin的抑菌圈直径为0mm，CK的抑菌圈直径为（14．01±0．34）mm。表明，胃蛋白酶能使其完全失去活性，胰蛋白酶、蛋白酶K 和α凝乳蛋白酶能使其部分失活。由此也表明，此抑菌物质是一类蛋白类（多肽）物质。细菌素是一类由细菌核糖体合成的抗菌蛋白类物质，菌株416所产抑菌物质在排除酸抑制及过氧化氢抑制后，经过蛋白酶水解试验证实其蛋白性质，由此可确定此抑菌物质是一种细菌素。

图2 菌株416产抑菌物质的蛋白酶敏感性Fig．2 Sensibility of bacteriostatic substance produced by strain 416to different proteases

2．4菌株416产细菌素对其他菌的抑菌效果

试验表明，菌株416所产细菌素是一种广谱抑菌活性细菌素，不但对革兰阳性菌有抑菌效果，对革兰阴性菌也有抑菌效果。其中，对金黄色葡萄球菌（G＋菌）的抑菌圈直径大于18mm，对大肠杆菌（G－菌）和蜡样芽孢杆菌（G＋菌）的抑菌圈直径为13～18mm，对李斯特菌（G＋菌）的抑菌圈直径为9～13mm。

大部分细菌素只能抑制与其亲缘关系较近的细菌，只有极少部分细菌素具有广谱抑菌活性，这部分细菌素是研究的重点［18－19］。菌株416能产对G＋和G－菌都有抑制效果的细菌素，其中，金黄色葡萄球菌的抑菌圈达18mm以上，说明其抑菌活性很强。从初步的抑菌谱试验可以得知，此菌株具有广谱抑菌活性，应用前景较好。

3结论与讨论

乳酸菌产生的抑菌物质很多，有酸性物质、过氧化氢、CO2和细菌素等。筛选乳酸菌产广谱抑菌作用的细菌素，必须先确定能产生抗菌物质，再排除酸性物质和过氧化氢的干扰，确定抑菌物质是细菌素（蛋白类）。本试验从贵州省特有传统发酵食品中逐步筛选出菌株416，在排除有机酸和过氧化氢等干扰因素后，其发酵液对G＋和G－菌仍有非常高的抑菌活性，通过生理生化试验和16SrDNA序列同源性分析鉴定，此菌株为植物乳杆菌。对此菌株产生的抑菌物质进行进一步研究后确定其为蛋白类物质，具有作为生物防腐剂应用于食品行业的潜力。

乳酸菌细菌素指由乳酸菌代谢分泌产生的一类细菌素，乳酸菌细菌素来源上的安全性及效果上的显著性使其越来越受到重视，如利用部分乳酸菌细菌素能产生广谱抗菌物质，能促生长，保健及治疗疾病的功能制备成无毒副作用、无残留和无细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。利用细菌素无免疫原性及对人无毒副作用等特点，在食品工业领域作为食品添加剂等。因而乳酸菌细菌素在食品工业上有极好的应用前景。下一步的工作是研究菌株416产细菌素的一级结构，热稳定性、酸碱稳定性及抑菌机理，为后续应用于食品防腐奠定理论基础。

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（责任编辑：王 海）

畜牧·兽医·水产

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery

Screening and Identification of a Lactobacillus plantarumStrain with Efficient Broad－spectrum Bacteriostatic Activity

HU Meizhong，ZHANG Xinzhuo，LIU Yun
（Tongren Polytechnic，Tongren，Guizhou550025，China）

L．plantarumstrains were screened from Guizhou traditional fermentation food by agar－spottest，then the L．plantarumstrain with the best bacteriostatic effect was screened by agar diffusion method and finally the antibiotic substance of the L．plantarumstrain screened by physiological and biochemical identification and 16SrDNA sequence homology analysis was identified to obtain L．plantarumstrains with efficient broad－spectrum bacteriostatic activity．Results：110 L．plantarumstrains are screened from Guizhou traditional fermentation food and stain 416with the best bacteriostatic effect is screened from 110 L．plantarumstrains．The antibiotic substance produced from stain 416（L．plantarum）is polypeptide，which has the strong inhibition effect on Bacillus cereus and Listeria monocytogenes and can be used as a biological preservative in food industry．

bacteriocin；bacteriostatic activity；Lactobacillus plantarum

S181

A

1001－3601（2016）02－0074－0096－04

2015－10－24；2016－01－20修回

铜仁市科技计划项目“食品的天然防腐剂——产广谱高效乳酸菌细菌素筛选及应用研究”［铜市科研（2012）61－1］

胡美忠（1981－），男，副教授，博士，从事食品微生物研究。E－mail：42554573＠qq．com