中国月季感染白粉菌后的蛋白质和糖类含量变化

杨发忠，杨德强，杨 斌＊

（1．西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，中国昆明650224；2．云南师范大学信息学院，中国昆明650092）

中国月季感染白粉菌后的蛋白质和糖类含量变化

杨发忠1，杨德强2，杨 斌1＊

（1．西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，中国昆明650224；2．云南师范大学信息学院，中国昆明650092）

为了对寄主植物介导的间接病虫互作机理研究奠定基础，采用光度分析法研究白粉菌侵染中国月季植株对植物体内糖类和蛋白质含量的影响。结果表明：中国月季（Rosa chinensis）感染白粉菌（Sphaerotheca pannosa）后，随着感病时间的延长，蛋白质含量逐渐下降，而总糖含量则呈先升高后降低的趋势；白粉菌侵染对中国月季叶片蛋白质和总糖含量的影响均存在明显的时间效应，随着感病程度增加，蛋白质和总糖的含量均明显降低，蛋白质含量从73．52mg／g降低至59．92mg／g，总糖含量从17．84mg／g降低至8．94mg／g。

中国月季；白粉菌；总糖；蛋白质；病虫互作关系；时间效应

1材料与方法

1．1材料

中国月季幼苗以及所需月季白粉菌均采自云南省昆明市呈贡区斗南花卉种植基地种植中国月季的大棚中。

仪器有WTJ7200型分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］，AL－204型电子天平［梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司］；试剂包括考马斯亮蓝G－250、葡萄糖、牛血清标准蛋白（bovine serum albumin，BSA）3种标准品，圴购自西格玛公司（Sigma－Aldrich，St Louis，MO，USA）。

1．2月季栽培

将采回的健康无病虫害的中国月季幼苗用基质在温室中进行栽培，适时浇水、施肥及防治病虫害。培育条件为27℃、70%RH、12h光周期。

1．3白粉菌接种及采样

从采回的带有白粉菌的中国月季叶片上用软毛刷轻轻将孢子刷下，并用无菌水配制成混悬液，再用软毛刷蘸取混悬液均匀刷在月季叶片上，置于光线充足、相对湿度90%、27℃、12h光周期条件下培养。以不接种的健康月季植株作对照，相同条件下培育于另一温室中。

接种后的第8天、12天和16天，分别采集接种白粉菌后的中国月季叶片，洗净、60℃干燥至恒重，－20℃冰箱中保存，用于测定叶片组织中总糖和蛋白质含量变化的时间效应。

另外，接种白粉菌时仅在定点位置接种，接种面积约为全叶面积的1／20。接种20d开始采样，根据孢子覆盖叶片面积占全叶面积的比例采集5种不同病级的中国月季叶片，1～5级表示孢子覆盖面积占全叶面积的比例分别为1／16、1／8、1／4、1／2、1／1。采集的叶片同法洗净、恒重、保存，用于测定总糖和蛋白质含量随感病程度的变化。

1．4叶片蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定参考Bradford［6］的方法稍有改动。标准曲线绘制：每组分别取不同体积BSA标准液（100μg／mL）探索最佳用量，在低（0．1～0．5μg／mL）、中（1～5μg／mL）、高（1～5μg／mL）3种浓度范围内绘制标准工作曲线，测定波长为595nm，均以蒸馏水为空白对照。选出较好的1条作为测定蛋白质的标准曲线。

叶片蛋白质含量测定：分别精密称取300mg健康或感染白粉菌的叶片组织，加入1．5mL蒸馏水，4℃匀浆，在12 000r／min、4℃下冷冻离心20min，得上清液。吸取上清液0．1mL于试管中再加入0．1mL蒸馏水、加入5mL考马斯亮蓝G－250试剂，混匀，于25℃下放置2min，在595nm下测定吸光度值，根据标准曲线计算风干叶片中的蛋白质含量（mg／g）。每种不同种类的叶片重复6次取平均值。

1．5叶片可溶性糖含量测定

可溶性糖含量测定使用苯酚－硫酸法［7］。用葡萄糖作标准品绘制标准工作曲线。精密称取健康或感染白粉菌的叶片组织500mg，加2mL蒸馏水常温匀浆，加5mL 3mol／L H2SO4，80℃水浴加热15min，12 000r／min离心20min，得上清液。取上清液1mL，加5%（wt／vol）的苯酚1mL和98%（wt／wt）的硫酸3mL，室温放置10min，490nm测定吸光度A的值，根据标准工作曲线计算风干叶片中的总糖含量（mg／g）。每种样品重复6次取平均值。

1．6数据统计

蛋白质和总糖含量测定结果统计分析均用SPSS 21．0（IBM－SPSS，Chicago，IL，USA）中的T检验进行。

2结果与分析

2．1接种白粉菌后月季叶片的蛋白质含量及总糖含量

1）蛋白质含量。以BSA为标准品绘制蛋白质标准工作曲线，在低浓度范围内，所得回归方程为A＝0．029 2 c－0．0062，R2＝0．802 6（其中，A为吸光度，c为BSA浓度，R为线性相关系数），回归方程的线性关系较差；而在中等浓度范围内为A＝0．030 3 c＋0．026 6，R2＝0．999 3，回归方程有很好的线性关系；在高浓度范围内为A＝0．010 5 c＋0．158 1，R2＝0．802 6，线性关系同样很差。所以，应选择中浓度范围内的标准工作曲线用于样品测定。在吸光光度法测定过程中，如果浓度太高，会偏离朗伯－比尔定律，使测定结果误差较大。浓度太高时，光路中处于后面的吸光点会被前面的吸光点挡住而未能正常吸光，所以一般引入负误差。同样浓度太低也会引入较大的误差，此时仪器误差可能超过由蛋白质本身引起的吸光度值的大小。从图1看出，与健康叶片相比，感病8d后叶片内蛋白质含量已经下降，并随感病时间延长而进一步降低，从73．96mg／g降低至62．92mg／g，差异达显著水平（P＜0．05）。

图1 中国月季接种白粉菌后不同时间叶片的蛋白质含量和总糖含量Fig．1 Leaf protein and carbohydrate content of R．chinensis plants inoculated with powdery mildew after different time

2）总糖含量。以葡萄糖作标准品、绘制苯酚－硫酸法测定的标准工作曲线，所得回归方程为A＝0．010 6 c＋0．010 0，R2＝0．999 6（其中，A为吸光度，c为葡萄糖浓度，R为线性相关系数），线性关系良好，可满足样品含量测定要求。图1结果表明，与健康中国月季叶片相比，感病8d后叶片内总糖含量不但没有下降，反而升高，尽管差异不显著。但是后来随感病时间延长而降低，从最高17．92mg／g（感菌8d后）降低至9．06mg／g，与蛋白质变化规律一致，差异也达显著水平（P＜0．05）。综合蛋白质和总糖测定结果可知，中国月季感染白粉菌8d后，植物体内生理生化代谢也受到明显影响，使蛋白质和总糖含量发生了变化。而且，当感病时间大于12d时，蛋白质和总糖的含量均明显降低。

2．2不同感病程度月季叶片的蛋白质含量和总糖含量

1）蛋白质含量。从图2看出，随着感病程度的增加，中国月季叶片蛋白质含量也发生变化。感染白粉菌后中国月季叶片内蛋白质含量显著降低，健康叶片（病级为0）蛋白质含量为73．52mg／g，感病程度最大5级叶片蛋白质含量为59．92mg／g，下降了18．50%，差异显著（P＜0．05）。总体来看，蛋白质含量也随着感病病级的增加而逐渐下降，呈负相关关系。

2）总糖含量。采用苯酚－硫酸法测定月季叶片内总糖含量结果（图2）表明，感病后总糖含量显著降低。健康叶片（病级为0）总糖含量为17．84mg／g，感病后至病级为5级（感病程度最大）时，总糖含量为8．94mg／g，下降49．89%，差异达极显著水平（P＜0．01）。但病级为1时，与健康叶片相比差异不显著（P＞0．05）。总体来看，总糖含量也随着感病病级的增加而逐渐下降，呈明显负相关关系。

图2 不同病级月季叶片的蛋白质含量和总糖含量Fig．2 Protein and carbohydrate content of R．chinensis leaves with different disease level

2．3感病后总糖和蛋白质含量变化

从表看出，感病后蛋白质含量和总糖含量均显著下降，蛋白质含量下降程度达显著水平（P＝0．010），而总糖含量下降程度则达极显著水平（P＜0．001）。同样，蛋白质与糖类含量的比值（P∶C）也发生了明显的变化，感病后P∶C比增大，这是由于感病后蛋白质含量下降程度（18．50%）与总糖含量下降程度（49．89%）相比较小所致。

表 中国月季感染白粉菌后叶片蛋白质和总糖含量Table Leaf protein and total sugar content of R．chinensis inoculated with powdery mildew mg／g

3结论与讨论

1）中国月季感染白粉菌后叶片内蛋白质和总糖含量与健康叶片相比均显著下降，并随着感病程度的增加糖类和蛋白质含量下降程度增加。同时，白粉菌侵染中国月季对叶片内2种营养成分的影响还存在时间效应。随着感病时间的延长，蛋白质含量逐渐下降；而总糖含量变化趋势则较复杂，呈先增加后明显下降的规律。关于植物病原菌侵染对寄主植物营养成分影响的研究较少，但也有研究表明，植物感病后各营养成分发生了变化。比如，链格孢属（Alternariaspp．）的一种真菌侵染红豆草（Onobrychis viciaefolia）后，红豆草茎叶可溶性糖和蛋白质含量明显升高［8］，该结果与本研究结果相反，表明植物病原菌侵染对寄主植物营养成分的影响因植物种类和病原菌种类不同而异。

2）白粉菌侵染中国月季对中国月季上的甜菜夜蛾有十分明显的抑制作用，感病后甜菜夜蛾幼虫取食量明显下降［1］。但是在病虫互作关系的研究中，病害对虫害的影响机理仍不清楚，缺乏寄主植物生理生化变化方面的直接证据。Simon等［2］的研究表明，柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）在被锈病（Melampsora allii－fragilis）感染的柳树杂交品种（Salix×cuspidate）叶上的取食量与健康柳叶相比明显降低，并根据甲虫的生物测试结果进行推测，认为锈病对甲虫造成不利影响重要原因之一是寄主植物水分和营养成分含量变化，但未获得植物营养成分变化方面的直接证据。尽管如此，可以推测，包括白粉菌在内的植物病原菌对昆虫造成影响的原因之一是植物体内各种营养成分的变化。本研究的结果表明，营养成分含量变化是甜菜夜蛾幼虫避免取食感染白粉菌的中国月季叶片的重要原因之一。Simon等［2］的研究同时表明，随着感病时间延长，柳蓝叶甲取食量明显减少，即存在明显的时间效应。而在本研究中，白粉菌侵染时间越长，最主要的2种营养成分糖类和蛋白质含量下降越明显，表明白粉菌侵染对营养成分含量的影响也存在明显的时间效应。因此，进一步说明白粉菌侵染诱导的植物体内营养成分变化是甜菜夜蛾受到不利影响的重要原因。

3）感染白粉菌8d后叶片的总糖含量高于健康叶片，原因可能是在白粉菌的诱导下，植物向感病部位运输可溶性糖的速率加快所致。Simon等［2］也根据柳蓝叶甲的取食行为做出类似的推断，认为在锈病的诱导下，糖类或其他营养物质会被集中到锈病侵染位置附近供应锈菌生长所需，同时引起柳蓝叶甲对该部分叶片的取食量明显增加。对白粉菌侵染中国月季后是否引起甜菜夜蛾取食量相应地发生变化尚无专门研究。感菌8d后的蛋白质含量则没有像总糖那样升高，可能因为运输的糖类主要用于白粉菌的生长，而未用于合成植物所需的蛋白质。感病时间大于12d时，无论是总糖还是蛋白质含量均明显降低，可能与植物体明显走向衰弱有关。

4）显而易见，蛋白质和总糖含量的变化对昆虫的取食会造成明显的影响。Lee et al［9］利用人工饲料进行的研究结果表明，当人工饲料中蛋白质与糖类的比值（P∶C）为14∶28时，莎草夜蛾（Spodoptera exempta）蛹重达到最大值，而当P∶C值为35∶7时蛹重最小，表明营养成分含量变化明显影响昆虫取食，即使营养成分总量不变，P∶C值的变化也会对昆虫生长发育带来明显影响。除蛋白质和总糖含量变化会影响到昆虫的生长发育外，二者比值的变化也可能影响到甜菜夜蛾幼虫的取食量。但Merkx－Jacques等［10］的研究则表明，甜菜夜蛾幼虫更偏向取食P∶C值大的人工饲料。本研究结果表明，感染白粉菌后的中国月季叶片中P∶C值显著增大、差异达显著水平，但甜菜夜蛾幼虫的取食量反而显著减小，与Merkx－Jacques et al［10］的研究结果相反。说明，在蛋白质和总糖含量显著降低的情况下，P∶C值增大没能对甜菜夜蛾幼虫取食带来促进作用。蛋白质和总糖的总含量变化对甜菜夜蛾幼虫取食带来的影响比P∶C值的影响要大得多，是主要影响因素。同样，Shen et al［11］的研究也表明，红棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）更愿取食4种健康寄主中粗蛋白含量最高的1种［红棕（Ravenea rivularis）］。

研究结果初步表明，中国月季感染白粉菌后甜菜夜蛾幼虫取食感病叶片的数量减少的原因之一是植物体内营养成分含量变化。从植物生理生化变化角度研究病害对虫害的影响机理，给寄主植物介导的间接的病虫互作关系的研究奠定了较好的基础。但是取食量的减少也可能与植物体内水分含量变化、各种次生代谢产物种类和含量变化等有关，需要在今后的工作中进一步深入研究。

［1］李 艳，杨发忠，杨 斌．感染白粉菌玫瑰对甜菜夜蛾幼虫取食与发育的影响［J］．西南林学院学报，2010，30（2）：44－46．

［2］Simon M，Hilker M．Does rust infection of willow affect feeding and oviposition behaviour of willow leaf beetles［J］．Journal of Insect Behavior，2005，18：115－129．

［3］Karban R，Adamchak R，Schnatthorst W C．Induced resistance and interspecific competition between spider mites and a vascular wilt fungus［J］．Science，1987，235：678－679．

［4］Rost S M，Simon M，Hilker M．Ecological crosseffects of induced plant responses towards herbivores and phytopathogenic fungi［J］．Basic and Applied Ecology，2003，4：43－62．

［5］Cardoza Y J，Alborn H T，TumLinson J H．In vivo Volatile emissions from peanut plants induced by simultaneous fungal infection and insect damage［J］．Journal of Chemical Ecology，2002，28：161－174．

［6］Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein－dye binding［J］．Analytical Biochemistry，1976，72：248－254．

［7］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al．Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］．Analytical Chemistry，1956，28：350－355．

［8］张俊忠，王 齐，朱建兰．黑斑病对红豆草营养成分的影响［J］．甘肃农业大学学报，2008，43（4）：118－120．

［9］Lee K P，Raubenheimer D，Behmer S T，et al．A correlation between macronutrient balancing and insect host－plant range：evidence from the specialist caterpillar Spodoptera exempta（Walker）［J］．Journal of Insect Physiology，2003，49（12）：1161－1171．

［10］Merkx－Jacques M，Despland E，Bede J C．Nutrient utilization by caterpillars of the generalist beet armyworm，Spodoptera exigua［J］．Physiological Entomology，2008，33，51－61．

［11］Shen X P，Ou S S，Xie Y J，et al．Correlation of microstructure of leaf sheath epidermis and nutrient composition of palm plants with the damage degree of red palm fiber elephant［J］．Plant Diseases and Pests，2010，1（2）：58－62．

（责任编辑：聂克艳）

Change in Protein and Carbohydrate Content of Rosa chinensis Infected with Powdery Mildew

YANG Fazhong1，YANG Deqiang Yang2，YANG Bin1＊
（1．Yunnan Key Laboratory for Warning and Control of Forest Disaster，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224；2．School of Information，Yunnan Normal University，Kunming，Yunnan 650224，China）

The carbohydrate and protein content in R．chinensis plants infected with powder mildew was determined by photometry analysis to lay the foundation for the interaction mechanism between diseases and pests indirectly mediated by host plants．Results：The protein content of R．chinensis plants infected with Sphaerotheca pannosa declines gradually but its total sugar content shows a first rising and then declining trend with prolongation of diseased time．Sphaerotheca pannosa infection has the obvious time effect on leaf protein and total sugar content of R．chinensis．The protein and total sugar content in leaves of R．chinensis deceases with increase of diseased degree significantly，and the protein and total sugar content decreases from 73．52mg／g to 59．92mg／g and from 17．84mg／g to 8．94mg／g respectively．

Rosa chinensis；powdery mildew；total sugar；protein；interaction between diseases and pests；time effect植物病原菌侵染寄主植物对植物体内营养成分变化的相关研究较少，白粉菌侵染中国月季能否诱导植物体内糖类和蛋白质含量变化国内外还未见文献报道。已有研究表明，白粉菌侵染中国月季对甜菜夜蛾取食产生了明显的抑制作用［1］，但造成这种抑制作用的原因还不清楚。同样，已有较多的研究表明，在植物病原菌－寄主植物－昆虫组成的三元系统中，存在着寄主植物介导的间接病虫相互作用［24］。植物病原菌侵染寄主植物可能对共享寄主的昆虫造成不利影响，但也可能造成有利影响［5］，或是没有影响，结果与植物种类、昆虫种类和病原菌种类有关。目前，对其影响机理的研究还未见文献报道。然而，研究寄主植物介导的间接病虫互作关系的植物保护学家根据所得相关结果进行推测，病害对虫害的影响与植物病原菌诱导的植物生理生化代谢的变化有着直接的关系［2，4］。病原菌侵染可能诱导植物水分含量变化、营养成分含量变化以及各种次生代谢产物含量变化等［2］，从而对昆虫产生有利或不利的影响。因此，中国月季感染白粉菌后植物体内糖类和蛋白质含量变化可能是甜菜夜蛾取食受到抑制的重要原因之一。为了对白粉菌侵染中国月季对甜菜夜蛾的影响机理提供依据，采用光度分析法研究白粉菌侵染中国月季植株对植物体内糖类和蛋白质含量的影响，研究感病对植物营养成分影响的时间效应，亦为寄主植物介导的间接病虫互作机理研究奠定基础。

S432．4＋4

A

1001－3601（2016）02－0070－0081－04

2015－05－02；2016－02－08修回

国家自然科学基金项目“白粉菌侵染玫瑰对甜菜夜蛾的影响及机理研究”（31160354）

杨发忠（1974－），男，副教授，硕士，从事植物保护方面的研究。E－mail：yangfazhong105＠163．com

＊通讯作者：杨 斌（1971－），男，教授，博士，从事森林保护方面的研究。E－mail：yangbin48053＠163．com