沉默Epha2对前列腺癌PC3细胞生物学性状与血管生成拟态的影响

曹　阳　李　清

421001 南华大学附属第一医院



沉默Epha2对前列腺癌PC3细胞生物学性状与血管生成拟态的影响

曹阳李清

421001 南华大学附属第一医院

【摘要】目的探究沉默Epha2基因对前列腺癌PC3细胞生物学性状的改变及对血管生成拟态的影响。方法培养人前列腺癌细胞株PC3(高表达EGFR，对EGFR-TK1吉非替尼敏感)，筛选对Epha2基因具有有效下调作用的siRNA序列，并利用筛选得到的有效siRNA转染PC3细胞，分别在RNA水平与蛋白水平观察Epha2的下调效果；转染细胞后，加入吉非替尼共培养48 h后，应用流式细胞仪检测细胞凋亡；同时，观察转染后对三维培养的模型条件下PC3血管生成拟态的影响。结果从设计的四条siRNA中筛选得到一条最有效下调Epha2基因表达的序列，利用该siRNA转染前列腺癌细胞PC3后，与对照组相比明显增强了吉非替尼诱导PC3细胞的凋亡，同时减少了PC3在三维培养条件下的血管生成拟态。结论抑制Epha2基因的表达可促进前列腺癌细胞PC3的凋亡，减少PC3的血管生成拟态，Epha2基因可作为临床治疗前列腺癌的靶点。

【关键词】前列腺癌；Epha2；血管生成拟态

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:545～547)

前列腺癌是老年男性常见的生殖系统恶性肿瘤，且发病年龄有降低的趋势[1-2]。血管生成拟态(VM)存在某些高度恶性肿瘤组织中，通过肿瘤细胞的自身变形和基质重塑形成类似血管样的通道，不仅缓解了肿瘤内缺血缺氧微环境，也与肿瘤侵袭、转移密切相关，使传统的抗肿瘤血管治疗效果不佳[3]。

EphA2作为EPh受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一，参与调节肿瘤细胞的生长、生存、迁移和侵袭，还涉及肿瘤血管形成和血管生成拟态的形成，促使网络状管道结构的形成，在许多肿瘤中高表达[4]。有研究表明通过转染增强EphA2的表达可提高前列腺癌LNCaP 细胞的增殖和侵袭能力[5]。然而在RNA干扰条件下观察Epha2沉默后对前列腺癌PC3细胞系生物学性状的改变及在三维培养的模型下观察其对血管生成拟态的影响，并在此基础上探讨其参与前列腺癌VM形成的机制却鲜有报道。

因此，本研究采用前列腺癌细胞株PC3筛选对Epha2基因具有有效下调作用的siRNA序列，并采用有效的siRNA对吉非替尼诱导细胞凋亡以及对PC3血管生成拟态的影响。

1材料与方法

1.1一般材料

人前列腺癌细胞株PC3购自中科院上海细胞库。Epha2-siRNA购自上海吉玛公司，转染试剂lipofectamine-2000、RNA提取试剂TRIzoL购自美国Invitrogen公司，天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtractTM(M-PEK)，Annexin-V/FITC凋亡试剂盒购自美国Biovision公司。抗体：Rabbit EPHA2 antibody、Goat Anti Rabbit IgG/HRP、Mouse GAPDH antibody和Goat Anti Mouse IgG/HRP购自美国SANTA cruz公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养前列腺癌细胞PC3用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2恒温保湿培养箱内培养。

1.2.2细胞转染按照说明书，在EP管中配制Epha2-siRNA及对照(scramble)与脂质体Lipofectamine2000的复合物，将配制好的混合液加入到无血清培养液洗涤的PC3细胞中，并分为三组[Epha2-siRNAs组、对照(scramble)组以及非转染组]，于37 ℃、5% CO2恒温保湿培养箱内培养6～8 h弃去培养液，换用含血清的RPMI-1640培养液继续培养，实验重复3次。

1.2.3RNA抽提与Q-PCR检测按照说明书，利用TRIzoL进行细胞的总RNA抽提并测定浓度，利用反转录试剂盒进行反转录，Q-PCR检测Epha2的表达情况，用GAPDH作为内参引物序列如下，Epha2正向引物：TGGCTCACACACCCGTATG；Epha2反向引物：GTCGCCAGACATCACGTTG；GPADH正向引物：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH反向引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.2.4细胞总蛋白提取与蛋白印记杂交检测利用RIPA裂解液对转染后48h的PC3进行裂解并提蛋白，BCA法测蛋白浓度后将各样本蛋白浓度调整至一致后进行点样，SDS-PAGE电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育2 h，二抗1 h后显影。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡将上述三组对数生长期的细胞接种于6孔板上24 h后加入0.01 μmol/L的吉非替尼，孵育48 h后弃去上清，每孔加入1 ml PBS洗后收集到离心管中，加入胰酶充分消化后加1 mL PBS洗涤并收集，离心并收集细胞，加入500 μL缓冲液重悬细胞使其密度为1×105个/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC，室温下避光孵育5 min后每管加入5 μL的PI，室温避光孵育5 min，上机检测。

1.3统计学处理

应用SPSS 11.0统计软件，配对资料比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1下调Epha2的siRNA序列筛选

设计并合成siRNA-444、733、1553、2191以及scramble序列并转染PC3细胞，48 h后分别利用Q-PCR技术与Western Blot技术检测Epha2的下调效果。如图1A所示，与siRNA-444，siRNA-733，siRNA-2191相比，siRNA-1553在RNA水平对Epha2下调效果最显著；如图1B所示，Western Blot显示siRNA-1533在蛋白水平对Epha2 的下调效果最显著。

图1　不同siRNA对PC3细胞中Epha2下调效果的比较

2.2Epha2-siRNA-1553增强了吉非替尼诱导PC3细胞的凋亡

siRNA转染PC3后，对吉非替尼诱导PC3的凋亡具有不同影响。如图2所示，正常PC3细胞经过吉非替尼孵育48h后凋亡率为3.86%；转染siRNA-scramble序列后的凋亡率为4.47%；而当转染siRNA-1553序列后，PC3在吉非替尼诱导下的凋亡率增高到16.33%。

图2　Epha2-siRNA-1553增加了吉非替尼诱导的PC3细胞的凋亡

2.3Epha2-siRNA-1553减少PC3在三维培养条件下的血管生成拟态

PC3细胞在三维培养条件下培养，转染siRNA-1553、scramble序列48 h后，显微镜下观察发现，与scramble对照组相比较，转染siRNA-1553组的血管生成拟态数目明显减少。

3讨论

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是老年男性常见的生殖系统恶性肿瘤，2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95%以上，因此，通常所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。中国近年来的前列腺癌发病率和死亡率都呈现上升趋势，2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。随着对前列腺癌生物学行为认识的不断深入，以及治疗理念的转变与更新，前列腺癌的治疗进入了综合治疗时代，形成了前列腺癌局部治疗与全身治疗并重的治疗模式。医生根据肿瘤的分期和患者的身体状况，采用手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段[6]，但是目前前列腺癌的治疗尚未获得突破性进展[7]。

EphA2作为EPh受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一，研究显示EphA2在人肿瘤中过表达，并且这种过表达与肿瘤的恶性程度存在正向的线性关系[8]。大量的实验证据证明，EphA2过表达与激活促进了肿瘤形成，说明EphA2可能是一个潜在的原癌基因[9-12]。EphA2在乳房上皮细胞过表达诱导了其形态转化[5]，在前列腺癌细胞系中升高的EphA2引起前列腺癌细胞的迁移与侵袭[10]。

我们的研究在首次在RNA干扰条件下观察沉默Epha2后对前列腺癌PC3细胞系生物学性状的改变及在三维培养的模型下观察其对血管生成拟态的影响，发现转染EphA2-siRNA后前列腺癌细胞PC3在吉非替尼诱导条件下细胞凋亡显著增加，同时在三维培养条件下EphA2-siRNA转染可有效减少PC3血管生成拟态的形成。目前的研究认为，EphA2在前列腺癌细胞PC3中下调之后对化疗药物吉非替尼诱导的肿瘤细胞凋亡有促进作用同时减少血管生成拟态，但是EphA2通过什么途径起到以上作用的具体分子机制仍需要我们进行下一步的研究。

综上所述，EphA2下调具有抵抗前列腺癌细胞对前列腺癌化疗药物吉非替尼的耐药性以及减弱PC3的血管生成拟态的作用。因此，EphA2是临床治疗前列腺癌的一个潜在的有效靶点。

参考文献

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(编辑：吴小红)

Effect of Epha2 Gene Silencing on the Properties and Vasculogenic Mimicry of Prostatic Cancer Cell Line PC3

CAOYang,LIQing.TheFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,421001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Epha2 gene silencing on the properties and vasculogenic mimicry of prostatic cancer cell line PC3.MethodsPC3 cells (EGFR high expression and sensitive to EGFR-TK1,such as gefitinib) were cultured and siRNA were transfected into PC3 cells,the most effective siRNA was picked through test of Q-PCR and Western blot.Epha2-siRNA were transfected and gifitinib were added into PC3 cells for 48h,then the apoptosis was measured by FACS.Meanwhile,the effect on vasculogenic mimicry of PC3 cultured in 3D condition was investigated.ResultsThe most effective siRNA-1553 was screened and PC3 cells apoptosis induced by gifitinib was increased and the vasculogenic mimicry of PC3 cultured in 3D condition was decreased apparently when transfected into PC3 cells.ConclusionThe inhibition of Epha2 gene expression by siRNA can promote the apoptosis induced by gifitinib and restrain the vasculogenic mimicry of prostatic cancer cell PC3,Epha2 gene might be a potential therapeutic target of prostatic cancer in clinic treatment.

【Key words】Prostatic cancer;Epha2;Vasculogenic mimicry

(收稿日期2015-12-14修回日期 2016-02-04)

中图分类号：R737.25

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)04-0545-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.007

通讯作者：李清