Twist表达与骨肉瘤临床病理特征及其转移的关系

李　艳　伊　航　李锦明　何智圣

430070 中国建筑第三工程局武汉中心医院



Twist表达与骨肉瘤临床病理特征及其转移的关系

李艳伊航李锦明何智圣

430070 中国建筑第三工程局武汉中心医院

【摘要】目的探讨Twist表达与骨肉瘤临床病理特征及其转移的关系。方法纳入骨肉瘤患者100例，应用免疫组织化学染色的方法，检测Twist在不同病理类型骨肉瘤中的表达；并检测骨肉瘤转移组和非转移组患者Twist表达情况。结果Twist表达主要位于细胞的胞质中，在骨肉瘤组织中其阳性率为83%；骨肉瘤恶性程度低组与恶性程度高组其表达情况具有统计学差异(P<0.05)，但不同病理类型的骨肉瘤病理组织中其表达差异无统计学意义(P>0.05)；Twist在转移组骨肉瘤患者中阳性率为93.1%，在非转移组中阳性率为46.2%，两组比较具有统计学差异(P<0.05)。结论Twist与骨肉瘤的发病密切相关，可作为临床判断骨肉瘤的辅助性指标，对临床的诊治及预后的判断具有一定的指导价值。

【关键词】Twist；骨肉瘤；病理分型；肿瘤转移

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:548～551)

骨肉瘤的发病率是恶性骨肿瘤中发病率的首位，其发病年龄偏低，多为10~20岁的青少年，主要好发在长骨的骨干，男性患者多于女性，其主要的病理特点就是能产生大量的梭形肿瘤细胞，其恶性程度高，进展迅速，主要的治疗方法是手术配合化疗，但是其复发率高，生存率低，对患者的生存质量产生重大的影响[1-2]。随着现代分子生物学和遗传学的发展，该病与相关基因的激活及抑癌基因的失活具有密切的相关性，近年来Twist基因不断被人们所认识，该基因是一种高度保守的转录调节因子，其表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系，特别是对于肿瘤的转移有着重要的影响，但是目前对于该基因在骨肉瘤的影响报道尚少[3-4]。本研究采用免疫组织化学染色的方法检测Twist基因在人类骨肉瘤中的不同分型中的表达差异，结合病理分型和分级对表达差异情况进行研究，并搜集所纳入研究的患者术后发生转移及非转移情况，评价其对骨肉瘤转移的影响，为进一步阐明该基因在骨肉瘤的发病、预后中的作用，也为今后的基因靶向治疗提供依据，现报告如下。

1材料与方法

1.1一般资料

纳入我院2012年1月至2013年1月确诊为骨肉瘤的患者100例，其中男性69例，女性31例，平均年龄(26.25±10.23)岁，所有纳入研究的骨肉瘤患者均手术后取活检，其中在股骨38例，胫骨24例，肱骨14例，腓骨12例，上下颌骨10例，跟骨2例，在术前均未进行化疗，且未出现转移。所有的获取的标本经HE染色按组织学分型，可分为软骨母细胞型26例、骨母细胞型24例、纤维母细胞型36例、混合型14例。根据恶性程度进行分级分为3级：其中1级26例，2级40例，3级34例，对患者进行随访2年，其中转移组为2年内出现转移或因转移瘤而死亡的患者共58例，非转移组为术后未发生转移并且生存期超过2年的共26例，失访患者为16例。

1.2诊断标准

参照《骨科肿瘤学》[5]对骨肉瘤的诊断标准进行制定。

1.3纳入标准

①符合本病诊断标准；②年龄3～60岁；③依从性强，愿意接受本临床研究。

1.4排除标准

①年龄<3岁或>60岁的患者，妊娠期、哺乳期的患者；②有严重其他系统疾病和恶性肿瘤的患者；③不愿意接受本临床研究，依从性差的患者。

1.5方法与试剂

1.5.1主要试剂、细胞与仪器试剂：免疫组化试剂盒(武汉博士德)，HRP标记山羊抗小鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)，抗体：Twist兔单克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG(美国Santa Cruz公司)。

仪器：倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)，高转速冷冻离心机(德国BiofugeStratos)，-80 ℃-4 ℃冰箱(日本松下)。

1.5.2免疫组化方法采用SP免疫组织化学方法，取二甲苯脱蜡后的骨肉瘤组织切片，无水乙醇分级水化，以0.01 mol/L PBS洗3次，40 g/L的多聚甲醛固定15 min，体积分数3%的双氧水消除内源性过氧化物酶15 min，50 μl非免疫动物血清封闭，加50 μl Twist一抗过夜，50 μl生物素标记第二抗体，辣根过氧化物酶孵育，DBA显色，苏木精复染，中性树胶固封。结果判定：阳性细胞为细胞胞质胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色，平均光密度应用Image J软件进行测量。

1.6实验结果的判定

阳性结果判定：Twist染色颗粒位于胞质之中。通过显微镜10×40倍视野，每张切片对应随机纳入10个视野进行阳性细胞计数，阳性细胞数大于50%为强阳性(+++)，25%～50%为阳性(++)，0～25%为弱阳性(+)，未着色为阴性(-)。

1.7统计学处理

2结果

2.1Twist在骨肉瘤组织中的表达

观察Twist在骨肉瘤中的表达，结果显示，免疫组化阳性染色位于细胞质内，也有位于细胞核内，呈棕色或者褐色，100例骨肉瘤组织中83例阳性染色，其中弱阳性20例，中度阳性28例，强阳性35例，与正常人体组织Twist表达相比较具有显著地统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1　Twist在骨肉瘤组织中的表达/例

注：①为与正常对照组相比，P<0.05。

2.2Twist表达与骨肉瘤病理类型的相关性

研究结果显示，Twist在骨肉瘤不同病理组织类型中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　Twist表达与骨肉瘤病理类型的相关性(例，%)

2.3Twist 在不同恶性分级骨肉瘤的表达情况

骨肉瘤根据恶性程度分为3级，其中1级26例中有14例Twist阳性，2级40例中有36例为阳性，3级34例中有33例为阳性，经统计3级中Twist阳性率高于2级和1级的，2级Twist阳性率又高于1级，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　Twist在不同恶性分级骨肉瘤中的表达情况(例，%)

注：与1级相比，①为P<0.05；与2级比较，②为P<0.05。

2.4Twist 在骨肉瘤转移组与非转移组中表达差异性情况

Twist在转移组骨肉瘤患者中阳性率为93.1%，在非转移组中其阳性率为46.2%，两组比较具有统计学差异(P<0.05)，见表4。

表4　Twist 在骨肉瘤转移组与非转移组中表达差异性

3讨论

骨肉瘤是起源于间叶组织，为青少年最常见的原发恶性骨瘤，大多数情况下肿瘤细胞产生不成熟的骨质或骨，其发展迅速，主要病变部位位于长骨干骷端，侵袭性强，可出现全部组织器官的转移，肺部转移较为常见，该病预后较差，经积极治疗后5年的存活率仅为70%[6-7]。目前主要的治疗方法是手术及全身化疗的综合治疗方法，但是还是存在复发和转移的可能，给患者造成了严重的经济负担，由于疾病发病隐匿，进展很快，很多患者就诊时已到达晚期，同时目前还缺乏骨肉瘤的诊断和治疗靶标，因此寻找生物学靶标对于疾病的诊治至关重要，本研究为探求该病的侵袭机制，寻找靶点基因与疾病的相关性，对该病的治疗和预后判断提供一定的指导价值[8]。目前，仅少量报道关于骨肉瘤中Twist 的表达情况，但缺乏对Twist 与骨肉瘤关系的更深入研究和病例报道，本研究对骨肉瘤的深入研究具有重要的研究意义[9-10]。

目前研究显示， Twist基因属于1种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋转录调节因子，已被发现其该基因存在于鼠类、果蝇、鱼类和哺乳动物等多种动物体内[11]。最新的几年研究发现Twist可作为1种癌基因，不仅是是上皮-间质转变过程中的关键因子，且Twist与肿瘤的发生发展密切相关，影响肿瘤细胞的凋亡，其高表达可能促进癌细胞的恶化，可以视为1种癌基因和凋亡抑制蛋白，表达水平与肿瘤各亚型的恶性程度也密切相关，可抑制凋亡呈现出抗凋亡的激活，增强细胞的抗凋亡能力[12-14]。有研究表明该基因可以通过多条通路抑制癌基因的正常表达和转录，发挥抑制癌细胞凋亡的作用，促进肿瘤的发展。已有的研究包括前列腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、食管癌等，但是在骨肉瘤中的研究尚少[15]。研究还证实了该基因及肿瘤细胞的转移和侵袭有关，通过降低黏附蛋白的表达，抑制细胞转录水平，从而有助于肿瘤的侵袭，进而促进肿瘤血管生成[16-17]。因此，Twist不仅与肿瘤形成有关，还与肿瘤的转移相关。本研究结果显示，Twist表达主要位于细胞的胞质中，在骨肉瘤患者的组织中阳性率为83%，这说明该基因在骨肉瘤中具有高表达的表现，其可能的机制是通过抑制肿瘤细胞的凋亡有关；骨肉瘤低级与高级组的表达情况之间具有统计学差异，说明该基因在病理分型表达没有差别，但不同分型的骨肉瘤病理组织的表达差异无统计学意义；Twist在转移组的骨肉瘤患者中阳性率为93.1%，在非转移组中的阳性率为46.2%，两组比较具有统计学差异，这也提示了该基因可能参与了骨肉瘤的转移和侵袭过程。

综上所述，我们推测，Twist可能通过其抑制细胞凋亡和促侵袭的作用对骨肉瘤的发生发展发挥调控作用。本研究阐明了骨肉瘤的分子相关性，但是其主要的发病机制有待于深入的研究，同时通过本研究也为骨肉瘤的临床诊断和预后判断提供了新的策略方法，确定了Twist与骨肉瘤的相关性，研究了不同病理分型和分级对其表达的差异，探讨了该基因对骨肉瘤的生物学相关性，也为今后进一步对骨肉瘤的诊治提供理论依据。

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(编辑：吴小红)

Relation between Twist Expression and Clinicopathological Features and Metastasis of Osteosarcoma

LIYan,YINHang,LIJinming,etal.ChinaConstructionThirdEngineeringBureauWuhanCentralHospital,Wuhan,430070

【Abstract】ObjectiveTo study the relation between Twist expression and clinicopathological features and metastasis of osteosarcoma.Methods100 patients with osteosarcoma were collected,immunohistochemical staining method was used to detect Twist expression in different pathological types of osteosarcoma;and Twist expression of osteosarcoma metastasis patients and non-metastasis patients were detected.ResultsTwist expression was mainly located in the cytoplasm,its positive rate was 83% in osteosarcoma;Twist expression between osteosarcoma low malignancy group and high malignancy group had significant difference (P<0.05),but Twist expression in different pathological types of osteosarcoma had no significant difference (P>0.05);Twist positive rate in patients with osteosarcoma metastasis was 93.1%,in the non-metastasis group was 46.2%,there had statistical difference (P<0.05).ConclusionTwist is closely associated with the incidence of osteosarcoma,it can be secondary indicators for clinical judgment of osteosarcoma,and it has guiding value for the diagnosis and prognosis of clinical significance.

【Key words】Twist;Osteosarcoma;Pathological classification;Tumor metastasis

(收稿日期2015-07-17修回日期 2016-03-04)

中图分类号：R738.1

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)04-0548-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.008

通讯作者：何智圣